馬高恩 焦云娟 賀 琳 劉向玲

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(retinoblastoma，RB)是臨床常見嬰幼兒眼內(nèi)惡性腫瘤之一，每年新發(fā)例數(shù)約占嬰幼兒惡性腫瘤總例數(shù)的3%，早期及時(shí)、有效治療生存率高，若延誤治療時(shí)機(jī)，病灶擴(kuò)展至眼外，則可能造成低視癥和眼盲，甚至死亡，對患兒家庭造成嚴(yán)重影響[1]。目前，RB臨床治療主要包括外科手術(shù)輔助放化療等，但由于外科手術(shù)侵襲性強(qiáng)，放化療不良反應(yīng)較大，且易出現(xiàn)化療藥物耐藥性等問題，臨床治療效果不理想[2]。因此，尋找安全、有效的抗RB藥物仍是臨床研究的重點(diǎn)。粉防己堿(tetrandrine，Tet)是從天然植物中提取的一種生物堿，研究發(fā)現(xiàn)，Tet除具有解熱鎮(zhèn)痛、血管擴(kuò)張、抗菌消炎等藥理學(xué)作用外，其在抗腫瘤方面也具有潛在應(yīng)用價(jià)值[3,4]。已有研究證實(shí)，Tet具有抗乳腺癌作用，但關(guān)于其對人RB增殖及凋亡影響的研究仍較少[5]。本研究設(shè)計(jì)體外實(shí)驗(yàn)，通過檢測不同濃度Tet對人RB細(xì)胞株S0-Rb50增殖及凋亡的影響，并進(jìn)一步探討其作用機(jī)制，為Tet在RB臨床治療中的應(yīng)用提供參考。

材料與方法

1.材料：人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞株S0-Rb50購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。粉防己堿(Tet，美國Sigma-Aldrich公司，純度≥90%)，RPMI1640培養(yǎng)基、小牛血清(美國Hyclone公司)，BCA蛋白定量分析試劑盒(美國Thermo公司)，磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)、磷酸化Akt(phosphorylated，pAkt)、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B lymphocyte tumor-2 gene，Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 related X protein，Bax)、裂解的含半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved caspase-3)一抗及二抗(美國Cell Signaling Technology公司)，Annexin-FITC/PI凋亡試劑盒(美國BD公司)；VersaMAX型酶標(biāo)儀(美國Molecular Dvices公司)，7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國ABI公司)，電泳儀、Tanon 5200化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)。

2.細(xì)胞培養(yǎng)、干預(yù)及形態(tài)學(xué)觀察：人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞株S0-Rb50培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基(含10%小牛血清、1%青鏈霉素)、37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱，取對數(shù)期生長細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度，以1.5×105個(gè)/毫升接種于96孔板，隨機(jī)分為4組，即對照組、Tet低、中、高劑量組，每組5個(gè)復(fù)孔；待細(xì)胞重新貼壁生長至80%時(shí)，分別更換濃度為0、2.5、5.0、10.0μmol/L Tet細(xì)胞培養(yǎng)液，干預(yù)24h后于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

3.MTT法檢測各組細(xì)胞增殖情況：取干預(yù)24、48、72h時(shí)各組細(xì)胞，加入5mg/ml的新鮮制備的四唑鹽(tetrazolium salt，MTT)溶液20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄去上層培養(yǎng)液，加入DMSO 150μl，充分震蕩至澄清，測定570nm處吸光度(optical density，A)值。

4.流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡情況：取干預(yù)24h時(shí)各組細(xì)胞，預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer，PBS)洗滌細(xì)胞2次，2000r/min離心8min，棄去上清后加入1.0ml碘化丙啶(propidium iodide，PI)，混勻室溫靜置15min，流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞周期分布情況。取干預(yù)24h時(shí)各組細(xì)胞，計(jì)數(shù)1×106個(gè)細(xì)胞與0.5ml上樣緩沖液、5μl Annexin V-FITC、5μl PI充分混勻，避光孵育15min，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率。

5.實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR)法檢測蛋白表達(dá)情況：取干預(yù)24h時(shí)各組細(xì)胞，Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA模板，應(yīng)用SYBR Premix Ex Taq試劑盒進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增，按照試劑盒說明書設(shè)定反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性32min；95℃變性20s，57℃退火40s，72℃延伸40s，重復(fù)42個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參基因，2-△△CT為目的基因的相對表達(dá)強(qiáng)度，計(jì)算PI3K、Akt、Bcl-2、Bax mRNA相對表達(dá)量。引物序列詳見表1。

6.Western blot法檢測蛋白表達(dá)情況：取干預(yù)24h時(shí)各組細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，震蕩混勻后4℃、12000r/min離心10min，收集上清液進(jìn)行BCA蛋白定量，取15μg與等量上樣緩沖液混勻后沸水浴5min，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰氨凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜，封閉液常溫封閉2h，加入一抗4℃搖床孵育過夜，洗膜后加入對應(yīng)二抗常溫孵育1h，洗膜后進(jìn)行曝光和顯影；應(yīng)用灰度值分析軟件進(jìn)行掃描拍照，以PI3K、pAkt、Akt、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3與內(nèi)參β-actin灰度值比值表示蛋白相對表達(dá)量。

表1 引物序列

結(jié) 果

1.各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：倒置相差顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，對照組細(xì)胞形態(tài)規(guī)則、融合成片，不同干預(yù)組細(xì)胞隨Tet濃度升高細(xì)胞體積逐漸減小、核質(zhì)比例減小，不能融合成片，視野內(nèi)漂浮細(xì)胞或細(xì)胞崩解碎片增多，詳見圖1。

2.各組MTT試驗(yàn)A值比較：各時(shí)刻MTT試驗(yàn)A值組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與對照組比較，Tet高劑量組干預(yù)24h時(shí)A值較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Tet各劑量組干預(yù)48、72h時(shí)A值均較低，且隨干預(yù)劑量升高呈降低趨勢，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。對照組MTT試驗(yàn)A值隨干預(yù)時(shí)間的延長呈升高趨勢(P<0.05)，Tet高劑量組MTT試驗(yàn)A值隨干預(yù)時(shí)間的延長無明顯變化(P>0.05)，詳見表2。

3.各組細(xì)胞周期分布情況比較：G0/G1、S、G2/M期細(xì)胞占比組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與對照組比較，Tet各劑量組G0/G1、S期細(xì)胞占比較低，G2/M期細(xì)胞占比較高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與Tet低劑量組比較，Tet中、高劑量組G0/G1、S期細(xì)胞占比較低，G2/M期細(xì)胞占比較高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與Tet中劑量組比較，Tet高劑量組G0/G1、S期細(xì)胞占比較低，G2/M期細(xì)胞占比較高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見表3。

圖1 倒置相差顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)(×400)A.對照組；B.Tet低劑量組；C.Tet中劑量組；D.Tet高劑量組

表2 各組MTT試驗(yàn)A值比較

與對照組比較，*P<0.05；與低劑量組比較，#P<0.05；與中劑量組比較，△P<0.05；與本組內(nèi)24h比較，▲P<0.05；與本組內(nèi)48h比較，&P<0.05

表3 各組細(xì)胞周期分布情況比較

與對照組比較，*P<0.05；與低劑量組比較，#P<0.05；與中劑量組比較，△P<0.05

4.各組細(xì)胞凋亡率比較：細(xì)胞凋亡率組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與對照組比較，Tet各劑量組細(xì)胞凋亡率較高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與Tet低劑量組比較，Tet中、高劑量組細(xì)胞凋亡率較高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與Tet中劑量組比較，Tet高劑量組細(xì)胞凋亡率較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見表4、圖2。

表4 各組細(xì)胞凋亡率比較

與對照組比較，*P<0.05；與低劑量組比較，#P<0.05；與中劑量組比較，△P<0.05

5.PI3K、Akt、Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)量比較：PI3K、Bcl-2、Bax mRNA相對表達(dá)量組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與對照組比較，Tet各劑量組PI3K、Bcl-2 mRNA相對表達(dá)量較低，Bax mRNA相對表達(dá)量較高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與Tet低劑量組比較，Tet中、高劑量組PI3K、Bcl-2 mRNA相對表達(dá)量較低，Bax mRNA相對表達(dá)量較高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與Tet中劑量組比較，Tet高劑量組PI3K、Bcl-2 mRNA相對表達(dá)量較低，Bax mRNA相對表達(dá)量較高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),詳見表5。

6.PI3K、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)量及pAkt/Akt比較：PI3K、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3蛋白相對表達(dá)量及pAkt/Akt組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)； 與對照組比較，Tet各劑量組PI3K、Bcl-2蛋白相對表達(dá)量及pAkt/Akt較低，Bax、cleaved caspase-3蛋白相對表達(dá)量較高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與Tet低劑量組比較，Tet中、高劑量組PI3K、Bcl-2蛋白相對表達(dá)量及pAkt/Akt較低，Bax、cleaved caspase-3蛋白相對表達(dá)量較高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與Tet中劑量組比較，Tet高劑量組PI3K、Bcl-2蛋白相對表達(dá)量及pAkt/Akt較低，Bax、cleaved caspase-3蛋白相對表達(dá)量較高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),詳見表6、圖3。

圖2 Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況A.對照組；B.Tet低劑量組；C.Tet中劑量組；D.Tet高劑量組

表5 PI3K、Akt、Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)量比較

與對照組比較，*P<0.05；與低劑量組比較，#P<0.05；與中劑量組比較，△P<0.05

表6 PI3K、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)量及pAkt/Akt比較

與對照組比較，*P<0.05；與低劑量組比較，#P<0.05；與中劑量組比較，△P<0.05

圖3 Western blot法檢測蛋白表達(dá)情況A.對照組；B.Tet低劑量組；C.Tet中劑量組；D.Tet高劑量組

討 論

RB是人類特有的一種眼內(nèi)惡性腫瘤，多發(fā)生于出生后7～24個(gè)月，對患兒的視力和生命造成嚴(yán)重危害[6]。為提高患兒的生存質(zhì)量，臨床治療主要趨勢為避免眼球摘除、放療等侵襲性強(qiáng)的治療手段，盡量保留患兒視力，因此，尋找有效藥物及靶向作用通路有重要意義。RB主要包括遺傳性生殖細(xì)胞突變、非遺傳性視網(wǎng)膜細(xì)胞突變兩種類型，其發(fā)生和發(fā)展過程復(fù)雜，影響因素多樣，目前仍未完全闡明，主要涉及癌基因激活、增殖失控及凋亡機(jī)制異常等[7,8]。因此，抑制RB細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡是控制病情進(jìn)展的關(guān)鍵。

Tet屬于雙芐基異喹啉堿，是從粉防己、防己等常用中草藥植物根中提取的有效成分。研究表明，Tet對骨關(guān)節(jié)炎、支氣管哮喘、神經(jīng)母細(xì)胞瘤均有良好抑制作用[9～11]。張美峰等[12]研究發(fā)現(xiàn)，Tet可有效抑制人甲狀腺癌細(xì)胞B-CPAP增殖、促進(jìn)凋亡作用，且具有明顯劑量依賴和時(shí)間依賴性，與本研究結(jié)果相似。本研究通過倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，不同劑量Tet干預(yù)后各組細(xì)胞生長受到抑制，且呈現(xiàn)體積逐漸減小、核質(zhì)比例減小、漂浮細(xì)胞或細(xì)胞崩解碎片增多等不良生長狀態(tài)。通過MTT試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Tet各劑量組干預(yù)不同時(shí)刻A值均明顯降低，呈劑量依賴和時(shí)間依賴性，說明Tet可有效抑制S0-Rb50增殖。另外，本研究經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，Tet干預(yù)24h后G0/G1、S期細(xì)胞占比均降低，G2/M期細(xì)胞占比、凋亡率均升高，且均具有劑量依賴性，提示Tet可抑制S0-Rb50增殖、促進(jìn)凋亡，其中10.0μmol/L Tet干預(yù)效果最佳。由此，Tet對人RB細(xì)胞S0-Rb50具有增殖抑制和凋亡促進(jìn)作用，可以看出Tet在RB治療中療效可觀，為更多臨床試驗(yàn)的開展提供參考。

癌細(xì)胞增殖、凋亡過程涉及多條信號(hào)通路共同調(diào)控，通過調(diào)節(jié)信號(hào)通路進(jìn)而影響細(xì)胞內(nèi)相關(guān)基因的表達(dá)，可間接發(fā)揮調(diào)控癌細(xì)胞增殖及凋亡過程[13]。PI3K是由調(diào)節(jié)亞單位和催化亞單位組成的異源二聚體，當(dāng)胞外信號(hào)激活PI3K后，可使其下游效應(yīng)分子Akt發(fā)生膜轉(zhuǎn)位而磷酸化激活，Akt磷酸化進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)進(jìn)而調(diào)節(jié)其下游靶基因表達(dá)，參與調(diào)控細(xì)胞增殖過程[14，15]。PI3K/Akt信號(hào)通路激活后，可促進(jìn)其下游Bcl-2與Bax蛋白呈游離狀態(tài)，分布于線粒體內(nèi)的Bcl-2可抑制細(xì)胞色素C釋放，進(jìn)而抑制caspase-3活化，發(fā)揮凋亡抑制作用，而Bax可通過活化死亡效應(yīng)級聯(lián)反應(yīng)而促進(jìn)凋亡進(jìn)程[16,17]。本研究中Tet各劑量組干預(yù)24h后PI3K、Bcl-2 mRNA和蛋白相對表達(dá)量及pAkt/Akt均降低，Bax mRNA和蛋白、cleaved caspase-3蛋白相對表達(dá)量均升高，且均具有劑量依賴和時(shí)間依賴性，提示Tet可能通過抑制PI3K/Akt信號(hào)通路、下調(diào)Bcl-2 mRNA和蛋白、上調(diào)Bax mRNA和蛋白及cleaved caspase-3蛋白表達(dá)發(fā)揮抑制S0-Rb50細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡作用，可以看出Tet具有靶向作用于PI3K/Akt信號(hào)通路進(jìn)而影響其抗腫瘤效果，為臨床應(yīng)用Tet進(jìn)行靶向治療RB提供參考依據(jù)。

綜上所述，Tet可抑制人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞株S0-Rb50增殖，促進(jìn)凋亡，其中10.0μmol/L Tet干預(yù)效果最佳，可能與抑制PI3K/Akt信號(hào)通路及其下游相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)相關(guān)，在進(jìn)一步的研究中應(yīng)探討Tet是否存在其他調(diào)控通路發(fā)揮增殖抑制和凋亡促進(jìn)作用。本研究從體外水平驗(yàn)證了Tet抗視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤作用，為臨床前試驗(yàn)的開展提供參考，同時(shí)為Tet相關(guān)藥物的研發(fā)及應(yīng)用于臨床視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的治療提供數(shù)據(jù)支持。