張 祥 楊 洛 廖 敏 郝亞榮

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病的主要心臟并發(fā)癥之一，其發(fā)生率高、危險性高，與糖尿病患者心血管疾病的高發(fā)生率、高病死率密切相關[1]。大量研究發(fā)現(xiàn)，有5年糖尿病病史的患者DCM發(fā)生率在44.4%以上，8年病史時則增加到56%[2, 3]。

DCM是由廣泛的心肌血管疾病和糖尿病引起的心肌代謝紊亂引起的心肌壞死性疾病。由于DCM發(fā)病機制復雜，通常在發(fā)病后期才發(fā)現(xiàn)，目前尚無有效的治療方法[4]。然而,高血糖是DCM發(fā)病機制的啟動因素。研究發(fā)現(xiàn),在長期的高血糖狀態(tài)下,糖尿病患者心肌細胞葡萄糖和脂質(zhì)代謝紊亂,導致心肌細胞能量供應失衡，血管內(nèi)皮細胞和其他心肌組織損傷,最后導致心肌細胞肥大、壞死、凋亡和心肌間質(zhì)纖維化等病理變化[5, 6]。因此，糖脂代謝紊亂是DCM病理機制中的關鍵環(huán)節(jié)，有效控制和改善心肌細胞能量代謝是糖尿病心肌病的重要治療策略。

松果菊苷(echinoside)是從管花肉蓯蓉莖中分離出來的天然化合物，其主要化學成分是苯乙醇苷[7]。通過體內(nèi)外研究其已被證明具有抗氧化、抗疲勞、抗炎、提高記憶力與神經(jīng)保護、抗腫瘤、保護肝臟及免疫調(diào)節(jié)等作用[8]。筆者以往的研究已經(jīng)證實,ECH可以調(diào)節(jié)TGF-β及其下游基因的表達水平,改善db/db小鼠糖尿病腎病的腎纖維化進程[9]。因此，為了進一步揭示ECH對糖尿病心肌病心肌細胞損傷是否具有保護作用，并探討其可能的分子機制。本研究使用db/db小鼠作為DCM疾病模型,探究心肌細胞脂質(zhì)代謝紊亂關鍵調(diào)控蛋白PPAR-α及其下游信號通路中重要蛋白CPT -Ⅰ是否參與松果菊苷改善心肌細胞脂質(zhì)代謝的調(diào)控，以期為糖尿病心肌病的治療提供理論依據(jù)。

材料與方法

1.實驗動物:本研究采用從南京大學南京生物醫(yī)學研究所(中國南京)購買的成年雄性C57BLKS/J db/db小鼠和db/m小鼠(SPF級)，實驗動物許可證號為SCXK(蘇)2015-0001。購買后,動物分籠飼養(yǎng)于武漢大學人民醫(yī)院實驗動物中心標準飼養(yǎng)間,室溫20℃,相對濕度50%～60%, 24h光照晝夜循環(huán),適應性喂養(yǎng)1周,不給予任何降糖藥物。實驗程序經(jīng)武漢大學人民醫(yī)院實驗動物倫理學委員會批準，隸屬于武漢大學人民醫(yī)院動物飼養(yǎng)中心。

2.化學藥品和試劑：ECH原粉(批號150623)由上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司提供。本品為白色結晶粉末，采用高效液相色譜法(HPLC)測定其純度為94%。以乙醇和水為溶劑，在動物實驗中進行灌胃給藥。2%戊巴比妥鈉(上海嘉禾公司，批號10023418)；4%多聚甲醛(武漢谷歌生物技術公司，批號AS1075)；脫脂奶粉(中國伊利股份有限公司)；RT-PCR反轉錄試劑盒；熒光定量PCR試劑盒；蘇丹紅Ⅱ染色液(上海歌凡生物技術有限公司)。

3.主要儀器:全自動生化分析儀(ADVID2400，日本東京)；全自動顯微鏡BX63(日本Olympus公司)；基因擴增儀(美國ABI公司)；實時熒光定量PCR檢測儀(7500序列檢測系統(tǒng))(美國ABI公司)；DYY7C型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京六一儀器廠)；成像系統(tǒng)(Q-IMAGING公司)；血糖儀和試紙(美國新澤西州新布倫瑞克強生公司)。

4.動物分組及干預:動物隔離后，采用數(shù)字表法將db/db小鼠隨機分為糖尿病模型組(db/db組，n=10)和ECH治療組(db/db+ECH組，n=11)，db/m小鼠設為正常對照組(db/m組,n=9)。8周齡時，db/db組和db/m組小鼠按0.05ml/10g體質(zhì)量標準予以0.9%NaCl溶液灌胃10周，db/db+ECH組小鼠按等體質(zhì)量予以ECH 300mg/(kg·d) 灌胃10周。每周監(jiān)測3組小鼠的體質(zhì)量，觀察小鼠的攝食、飲水和活動情況。禁食8h后，每2周采取剪鼠尾法用血糖儀和試紙從鼠尾末端取血樣，測定空腹血糖水平。連續(xù)干預10周后，用2%戊巴比妥鈉腹腔注射(0.1ml/10g)麻醉小鼠。將毛細針插入眼眶后采集血液，快速分離血清后，放入-80℃冰箱保存待測。心臟灌注后，將心肌組織分離稱重，檢測心臟濕重。取少量左心室心肌組織采用4%多聚甲醛固定后，用于心肌組織切片染色觀察病理形態(tài)。其余心臟組織置于液氮中1h，-80℃冰箱保存，用于聚合酶鏈反應(RT-PCR)和Western blot法檢測。

5.血清生化指標檢測:18周齡時，將采集血樣在4℃離心20min(1200r/min)后，收集上層血清。采用全自動生化分析儀檢測血清總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、游離脂肪酸(triglyceride,FFA)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein-cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein-cholesterol,LDL-C)。

6.組織病理學觀察(HE染色和蘇丹紅Ⅱ染色):心臟組織切片，各組大鼠取5μm大小心臟組織，用HE染色制片，放置在光學顯微鏡下觀察心肌組織病理改變及心肌細胞凋亡程度。用蘇丹紅Ⅱ染色法觀察心肌細胞的脂質(zhì)積累。將左心室組織用10%多聚甲醛固定30min，用蘇丹紅Ⅱ染色液稀釋按比例3∶2稀釋保存液和水。將保存液置于室溫下10min，75%乙醇脫色，PBS沖洗15min。最后甘油明膠封片后，置于顯微鏡下觀察。

7.Western blot法檢測組織中PPAR-α、M-CPT-1、CD36和GLUT-4蛋白質(zhì)表達水平：取各組小鼠心臟組織(50mg)，用組織剪刀剪成小塊。加入蛋白裂解液，攪拌均勻。加入適量終濃度為1mmol/L的PMSF抑制組織蛋白降解，冰浴裂解20min；1200r/min離心10min，吸取上清液，用BCA法測定蛋白濃度。蛋白樣品與SDS-PAGE緩沖液(2×) 1∶1配平后，沸水浴變性10min。取50μg蛋白樣品進行SD-PAGE電泳，濕轉至PVDF膜上。5% 脫脂牛奶搖床封閉1h, 4℃下過夜。加入一級稀釋(1∶800)。洗膜后，分別加入兔抗兔二抗稀釋液(1∶5000)，室溫孵育1h，洗膜后進行掃膜顯色，并分析各組條帶蛋白灰度值。

8.RT-PCR檢測組織中PPAR-α、M-CPT-1、CD36和GLUT-4 mRNA水平:取各組小鼠心臟組織100mg, 按照Trizol試劑盒說明書提取總RNA，紫外分光光度計檢測純度和濃度，電泳檢測完整性。按照反轉錄試劑盒的說明進行反轉錄。預變性95℃30s，擴增40個循環(huán):PCR反應95℃5s, 60℃40s;溶解95℃15s, 60℃60s，95℃15s。選取管家基因GAPDH作為內(nèi)參照，使用ABI7500軟件2-ΔΔct法處理數(shù)據(jù)，引物序列詳見表1。

結 果

1.ECH對db/db小鼠一般情況的影響:通過實驗期間的持續(xù)觀察，發(fā)現(xiàn)db/db小鼠表現(xiàn)出明顯的多食、多食、多尿和肥胖癥狀，且活動度降低，體型明顯大于db/m組小鼠。本實驗每2周檢測各組小鼠空腹血糖。與db/m組小鼠比較, db/db組小鼠的空腹血糖從8周齡開始持續(xù)顯著增長,表現(xiàn)出明顯的高血糖癥狀(P<0.01，圖1)。在接下來的10周，db/db組小鼠和db/db+ECH組小鼠空腹血糖持續(xù)升高，而db/m組血糖水平保持穩(wěn)定水平。相較于db/db組小鼠，db/db+ECH組小鼠空腹血糖水平顯著下降(P<0.01)。db/db組心臟濕重較db/m組明顯減輕(P<0.01，表2)；而與db/db組小鼠比較，db/db+ECH組小鼠心臟濕重顯著增加(P<0.01)。相較于db/m組小鼠，db/db組小鼠體質(zhì)量明顯增加(P<0.01)；而經(jīng)過10周的ECH干預治療后，db/db小鼠體質(zhì)量顯著降低(P<0.05)。

2.ECH對db/db小鼠血清脂質(zhì)水平的影響：血清脂質(zhì)代謝水平檢測結果顯示，與db/m組小鼠比較，db/db組小鼠血清TC、TG、FFA、LDL-C顯著升高，HDL-C明顯降低(P<0.01,表3)。而經(jīng)ECH灌胃治療后，db/db+ECH組小鼠血清TC、TG、FFA、LDL-C水平顯著降低，HDL-C明顯升高(P<0.01)。

表2 ECH對db/db小鼠體質(zhì)量和心臟濕重的影響

與db/m組比較，*P<0.01；與db/db組比較，#P<0.05，##P<0.01

表3 ECH對db/db小鼠血清脂質(zhì)代謝的影響

與db/m組比較，*P<0.01；與db/db組比較，#P<0.01

3.ECH對db/db小鼠心臟病理形態(tài)變化的影響:實驗結束時，固定部分左心室心肌組織進行HE染色和蘇丹紅Ⅱ染色，各組光鏡下心肌組織結構變化如圖2所示。HE染色顯示db/m組心臟正常，心肌細胞排列清晰致密，結構清晰，細胞外基質(zhì)及纖維組織少。而db/db組心肌細胞明顯肥大壞死，心肌細胞排列紊亂，細胞外基質(zhì)沉積較少。與db/db組比較，db/db+ECH組心肌細胞形態(tài)減輕，細胞間隙縮小，排列規(guī)則，細胞外基質(zhì)沉積改善。蘇丹紅Ⅱ染色顯示，db/m組心肌細胞脂滴較少，無脂質(zhì)變性。db/db組小鼠心肌細胞發(fā)生嚴重的脂質(zhì)變性，可見不同大小的脂質(zhì)液泡。治療后小鼠心肌細胞脂質(zhì)沉積明顯減少。

圖2 ECH對db/db糖尿病小鼠心肌組織病理形態(tài)學變化的影響(×200)

4.各組db/db小鼠中PPAR-α、M-CPT-1、CD36和GLUT-4表達水平的變化:本研究分別通過免疫蛋白印跡和RT-PCR技術檢測PPAR-α、M-CPT-1及其下游關鍵因子GLUT-4、CD36的蛋白和mRNA表達水平。實驗結果表明, 相較于db/m組，db/db組小鼠PPAR-α、M-CPT-1、GLUT-4蛋白質(zhì)和mRNA水平顯著降低，CD36的表達明顯增加(P<0.05)。經(jīng)過ECH灌胃10周干預治療后，PPAR-α介導的脂質(zhì)代謝通路激活，PPAR-α、M-CPT-1、GLUT-4蛋白質(zhì)和mRNA水平顯著增加，CD36的表達明顯減少(P<0.01，圖3、圖4)。

圖3 各組小鼠心肌細胞PPAR-α、M-CPT-1、CD36和GLUT-4蛋白表達水平與db/m組比較，*P<0.01；與db/db組比較，#P<0.01

圖4 各組小鼠心肌細胞PPAR-α、M-CPT-1、CD36和GLUT-4 mRNA水平與db/m組比較，*P<0.05，**P<0.01;與db/db組比較，#P<0.05,##P<0.01

討 論

糖尿病患者長期高血糖狀態(tài)所致的糖尿病心肌病早期病理改變表現(xiàn)為心肌細胞代謝紊亂和簡單的心臟組織結構變化，后由于左心室心肌細胞體積、心室壁厚和重量增加、舒張功能降低，逐漸發(fā)展為心肌細胞凋亡、壞死和肥大、纖維化，導致明顯的舒張和收縮功能障礙，最終可能發(fā)展成缺血性心臟病和心力衰竭[5, 10]。在本研究中，db/db組小鼠的血糖和血脂水平隨著實驗的進行而顯著升高，db/db組小鼠表現(xiàn)出明顯的肥胖癥狀，體質(zhì)量較db/m組明顯增加。db/db組心肌細胞HE染色顯示明顯的病理變化，如心肌細胞明顯肥大壞死，排列紊亂，細胞外基質(zhì)少量沉積。蘇丹紅Ⅱ染色結果顯示，db/db組小鼠心肌細胞發(fā)生嚴重的脂質(zhì)變性，可見不同大小的脂質(zhì)空泡。這些結果都表明，db/db小鼠在長期高血糖狀態(tài)下表現(xiàn)出早期糖尿病心肌病癥狀。

心肌細胞脂質(zhì)堆積是糖尿病心肌病中一個重要的細胞損傷過程，加重了糖尿病心肌病心力衰竭的進程。PPAR-α被認為是多種脂肪酸氧化系統(tǒng)相關基因的關鍵調(diào)節(jié)因子，在脂質(zhì)代謝、細胞炎癥和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[11]。其中PPAR-α激活和改善細胞脂質(zhì)代謝的主要機制包括:①控制多種線粒體和過氧化物酶體脂肪酸β氧化的關鍵酶, 如脂肪酸氧化限制酶、肉毒堿棕櫚酰轉移酶-Ⅰ(carnitinepalmitoyltransferase-1, CPT -Ⅰ)等；②促進長支鏈脂肪酸的氧化[12, 13]；③激活后調(diào)節(jié)脂蛋白的合成和組裝，降低VLDL的含量[14]；④激活后間接調(diào)節(jié)膽汁酸合成，促進膽固醇排泄[15]；⑤激活后抑制炎癥基因的表達等。

CPT-1作為PPAR-α的下游關鍵基因共同參與了心肌細胞長鏈脂肪酸的新陳代謝, 抑制心肌細胞的脂質(zhì)毒性[12,14]。ATP是心臟正常運轉的基本能量來源，成人心臟功能主要依賴于游離脂肪酸(free acid，F(xiàn)A)的氧化分解，約占心臟能量供應的70%[16]。其余能量供應來源于碳水化合物，如葡萄糖和乳酸[17]。糖尿病患者心臟組織能量消耗的增加和心肌供能之間的不平衡能力是心肌代謝障礙的重要原因,主要是葡萄糖代謝供能的降低和FA新陳代謝的增加,導致心肌組織過度攝入FA氧化供能，心肌內(nèi)脂肪代謝產(chǎn)物積累,增加心肌細胞脂毒性，最終導致糖尿病心肌病的發(fā)生、發(fā)展[18]。

本研究中筆者觀察到在db/db糖尿病小鼠心肌細胞CD36表達相較于db/m小鼠顯著增加,表明db/db小鼠存在心肌細胞攝取過多的FA, 而由于M-CPT-1表達水平顯著降低，無法及時清除脂質(zhì)代謝產(chǎn)物，故導致心肌細胞脂質(zhì)堆積嚴重。另一方面,在糖尿病心肌病小鼠中, 由于PPAR-α表達被抑制，下游葡萄糖代謝關鍵基因GLUT-4表達水平降低，心肌葡萄糖氧化供能減少。為了維持心肌組織的正常供能，代償機制勢必會增加心肌細胞對FA的攝取，這也可以從另一個角度解釋CD36在心肌細胞中過表達的原因。

經(jīng)過ECH 10周干預治療后，筆者觀察到db/db+ECH小鼠的體質(zhì)量明顯低于db/db小鼠。雖然沒有降低到與db/m組相同的血糖水平，但與db/db組比較，ECH能夠顯著改善db/db小鼠高血糖狀態(tài)。HE染色和蘇丹紅Ⅱ染色顯示，與db/db組比較，ECH干預后db/db小鼠心肌細胞形態(tài)改善，細胞間隙縮小，排列較規(guī)則，細胞外基質(zhì)沉積改善，心肌細胞脂質(zhì)積累明顯減少。

ECH對db/db型糖尿病心肌病小鼠的脂質(zhì)代謝也有明顯的改善作用。在本研究中，從生化參數(shù)中積累的證據(jù)表明，ECH對DCM小鼠高血脂水平還具有改善作用。通過分析免疫印跡和RT-PCR的檢測結果,可以確認ECH通過調(diào)控PPAR-α表達水平改善心肌細胞脂質(zhì)積累的調(diào)控機制主要包括:①激活下游基因M-CPT-1 表達,抑制CD36基因的表達，從而抑制心肌細胞的FA過量攝入;②上調(diào)GLUT-4基因的表達，促進心肌細胞對葡萄糖的攝取和利用，改善心肌細胞糖脂代謝平衡。

綜上所述，db/db糖尿病小鼠存在心肌細胞糖脂代謝紊亂。本研究證實，ECH可顯著降低db/db小鼠的長期高血糖狀態(tài)，改善心肌細胞糖脂代謝紊亂的潛在機制可能與PPAR/M-CPT-1信號通路有關。雖然本研究為糖尿病性心肌病的治療提供了新的方向，但是ECH對改善DCM心肌損傷的保護作用還需要開展更深入的研究來進一步驗證。