周 洋 陳婷妍 美麗巴努·玉素甫

干眼(dry eye, DE)是常見的眼科疾病之一，指淚液的量、質(zhì)或流體動力學(xué)異常引起的淚膜不穩(wěn)定和(或)眼表損害，進而導(dǎo)致眼不適癥狀及視功能障礙[1]。干眼的發(fā)病機制復(fù)雜，炎癥、細胞凋亡、性激素水平等因素均被報道參與了干眼病理過程。然而，干眼病理過程的最終通路是淚膜不穩(wěn)定，淚液中電解質(zhì)濃度升高導(dǎo)致淚液滲透壓升高。因此，淚液的高滲透壓引起的眼表炎癥是該疾病的標(biāo)志[2,3]。響應(yīng)高滲應(yīng)激(HS)產(chǎn)生的活性氧(ROS)不僅會引發(fā)眼表氧化應(yīng)激，還會引發(fā)涉及核因子κB(NF-κB)和促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)的炎癥級聯(lián)反應(yīng)途徑產(chǎn)生各種促炎細胞因子和趨化因子[4]。

炎性小體(inflammasome)是由多種蛋白質(zhì)組成的復(fù)合體，能夠調(diào)節(jié)caspase-1的活化進而在天然免疫防御的過程中促進細胞因子前體pro-IL-1β和pro-IL-18的切割成熟[5]。其還能調(diào)節(jié)caspase-1依賴的形式編程性細胞死亡，誘導(dǎo)細胞在炎性和應(yīng)激的病理條件下死亡。其中，NLRP3炎性小體可以促進了IL-1β的成熟[6]。越來越多的證據(jù)表明，NLRP3參與了DE的發(fā)病機制。例如，在DE患者的眼表檢測到了NLRP3炎性小體[7]。在大鼠 DE模型中，HS誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS可以激活NLRP3炎性小體[8]。此外，也有研究表明，ROS誘導(dǎo)的NLRP3激活通過caspase-1導(dǎo)致IL-1β分泌的增加，突出了ROS-NLRP3-IL-1β信號通路在DE進程中的啟動作用[9,10]。因此，研究此重要步驟可能有益于控制DE中眼表炎癥的發(fā)生。

金雀異黃素(genistein，Gen)是一種存在于豆類作物和齒狀植物中的天然異黃酮，是有益于健康的化合物，具有抗氧化、抗炎、抗病毒感染、抑制腫瘤細胞增殖等作用[11～13]。金雀異黃素對免疫系統(tǒng)的影響也有廣泛的研究。然而，尚未有研究金雀異黃素對DE中NLRP3炎性小體活化的影響。因此，本研究旨在研究金雀異黃素在HS誘導(dǎo)的NLRP3炎性小體激活中的作用及其潛在機制。

材料與方法

1.試劑與材料：金雀異黃素(genistein)、胰蛋白酶、DMEM 培養(yǎng)基、氯化鈉、CM-H2DCFDA試劑盒、ELISA 試劑盒購自美國Sigma 公司，X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent 購自瑞士Roche公司，超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽還原酶測定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司，兔抗人NRF2抗體、兔抗人Lamin B、山羊抗兔 IgG抗體購自美國Millipore公司，TIRzol試劑盒、Prime Script TM RT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒、SYBR Premix Ex TaqⅡ 試劑盒購自日本TaKaRa公司。人永生化角膜上皮細胞(iHCEC)和原代角膜上皮細胞(priHCEC)購自美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心。

2.細胞培養(yǎng)與分組處理：iHCEC和priHCEC用包含10%胎牛血清、100U/ml青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，在 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。當(dāng)細胞生長至融合度達 80%～90%時，用 0.25% 胰蛋白酶消化5min。在DMEM 培養(yǎng)基中加入無菌飽和氯化鈉溶液，分別調(diào)整培養(yǎng)基滲透壓為 312mOsm/L(正常滲透壓)和350、400、450mOsm/L(高滲透壓)。將細胞隨機分成3組進行對應(yīng)處理：①對照組(312mOsm/L正常滲透壓培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞)；②高滲刺激組(分別使用350、400、450mOsm/L高滲透壓培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞)；③金雀異黃素組(細胞先在50μmol/L金雀異黃素中預(yù)處理30min，再在450mOsm/L高滲透壓培養(yǎng)基中培養(yǎng))。

3.CCK-8檢測：將iHCEC和priHCEC重懸，以1×104個/孔均勻鋪于 96 孔板中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24h。按分組給予不同處理繼續(xù)培養(yǎng)24h后，每孔加入10μl CCK-8溶液，孵育2h，在酶標(biāo)儀上450nm 處檢測各組吸光光度值。

4.細胞轉(zhuǎn)染 siRNA：將iHCEC以2×105個/孔接種至 24 孔板中進行相應(yīng)處理后，加入100μl Opti-MEM， 5μl X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent，混合均勻，加入1μg的NRF2 siRNA(陰性對照組加nc siRNA)，短暫渦旋后室溫孵育 20min。細胞在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24h后，丟棄上清，PBS洗滌3次，換用10%胎牛血清的 RPMI1640 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)進行后續(xù)操作。

5.ROS測定：將iHCEC以2×104個/孔的密度接種在96孔板中，按分組給予不同處理后培養(yǎng)24h。加入10μmol/L CM-H2DCFDA在37℃下孵育30min后，用PBS洗滌兩次，使用熒光顯微鏡進行觀察拍照，并在酶標(biāo)儀450nm 處檢測各組吸光光度值。

6.酶活性測定：將2×104個/孔的密度接種于96孔板中的各組iHCEC進行相應(yīng)處理后，加入適量的0.25%胰蛋白酶消化并收集細胞，離心棄上清，加入 RIPA 裂解液抽提各處理下的細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，之后按照試劑盒說明測定細胞中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(Catalase)和谷胱甘肽還原酶(GR)的活性。

7.免疫熒光染色：按不同處理iHCEC 24h 后，用4% PFA固定15min后，將細胞在室溫下用0.3% Triton X-100透化15min，加入免疫熒光封閉液，室溫封閉 30min，分別加入一抗8-OHdG (1∶100)4℃孵育過夜，次日PBS 漂洗 3 次，將細胞與Alexa Fluor 488標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)二抗(1∶500)暗室室溫孵育1h，DAPI染色10min，PBS漂洗 3 次，于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

8.ELISA檢測：收集不同處理后iHCEC和priHCEC細胞培養(yǎng)上清液加入96孔板，濕盒中4℃過夜；使用PBST洗板3次，加入2%小牛血清室溫封閉1h，每孔加入兔抗人IL-1β抗體(1∶100)，37℃孵育1h，洗板3次，各孔加入HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體(1∶5000)室溫孵育1h后終止反應(yīng)，洗板3次，四甲基聯(lián)苯胺過氧化物酶溶液顯色，于酶標(biāo)儀450nm 處測各孔的吸光度值。

9.Western blot法：使用 RIPA 裂解液抽提各處理后iHCEC細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，制備SDS-PAGE膠，進行凝膠電泳分離蛋白，切膠并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5% 脫脂奶粉室溫封閉 2h。分別加兔抗NRF2 (1∶1000)、兔抗Lamin B (1∶2000) 抗體，4℃孵育過夜；HRP標(biāo)記的山羊抗兔 IgG抗體(1∶5000)，室溫孵育 2h；采用 ECL發(fā)光顯影，使用Image-Pro Plus 6.0分析蛋白質(zhì)灰度值。

10.RT-PCR 檢測：使用TIRzol試劑盒提取各處理下iHCEC細胞總 RNA，用 Prime Script TM RT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒獲取第1鏈 cDNA。使用SYBR Premix Ex TaqⅡ 試劑盒檢測基因表達，以GAPDH 作為內(nèi)參基因。擴增體系：上游引物1μl、下游引物1μl、cDNA 2μl、SYBR Premix Ex TaqⅡ 12.5μl、無酶水8.5μl。擴增條件：95℃ 3min，95℃ 30s，58℃ 30s，58℃ 30s，40個循環(huán)。表達水平均使用2-ΔΔCt法來計算。由上海吉瑪公司設(shè)計并合成各個基因的引物，具體序列詳見表1。

表1 各基因qPCR引物序列

結(jié) 果

1.金雀異黃素對HS誘導(dǎo)的iHCEC和priHCEC細胞的保護作用：結(jié)合相關(guān)研究，本試驗選擇50μmol/L金雀異黃素進行預(yù)處理。將iHCEC和priHCEC在不同滲透壓培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后，與對照組比較，在HS 450mOsm/L時iHCEC和priHCEC活力降低到58.5%、50.7%(P<0.05)；而與HS 450mOsm/L比較，細胞在50μmol/L金雀異黃素預(yù)處理后再在HS 450mOsm/L培養(yǎng)基中培養(yǎng)，iHCEC和priHCEC的活性顯著提高(P<0.05)，細胞活性分別達到89.3%和78.9%。

圖1 CCK-8檢測不同處理后iHCEC和priHCEC細胞活性A.不同處理下iHCEC活性；B.不同處理下priHCEC活性；與對照組比較，*P<0.05；與450mOsm/L組比較，#P<0.05

2.金雀異黃素抑制HS誘導(dǎo)的NLRP3活化：與對照組比較，在HS 450mOsm/L下iHCEC和priHCEC細胞中IL-1β的分泌水平均顯著增加(P<0.01)，而用50μmol/L金雀異黃素預(yù)處理細胞，IL-1β的分泌水平均顯著降低(P<0.01,圖2)。使用450mOsm/L的高滲培養(yǎng)基刺激iHCEC后，RT-PCR結(jié)果表明，在HS誘導(dǎo)下NLRP3、CASP1、IL-1β和IL-18mRNA的表達水平較高，而50μmol/L金雀異黃素預(yù)處理細胞后再于HS 450mOsm/L培養(yǎng)，這些基因的表達水平均顯著下降(圖3，P<0.05)。

圖2 ELISA檢測不同處理后iHCEC和priHCEC細胞中IL-1β的分泌水平A.不同處理下iHCEC中IL-1β的分泌水平；B.不同處理下priHCEC中IL-1β的分泌水平；與對照組比較，*P<0.01；與450mOsm/L組比較，#P<0.01

圖3 RT-PCR檢測不同處理iHCEC中NLRP3、CASP1、IL-1B和IL-18 mRNA的表達水平*P<0.05

3.金雀異黃素通過激活NRF2抗氧化劑信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來抑制HS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激：ROS測定結(jié)果顯示，與對照組比較，在450mOsm/L HS 培養(yǎng)iHCEC細胞24h后，細胞內(nèi)ROS水平增加了約3倍(P<0.01)，而用50μmol/L金雀異黃素預(yù)處理可以阻止ROS的升高(圖4，P<0.01)。與對照組比較，在450mOsm/L HS 下，iHCEC細胞中的另一種氧化應(yīng)激的生物學(xué)標(biāo)志物8-OHdG升高了約6倍(P<0.01)，而50μmol/L金雀異黃素預(yù)處理同樣顯著地抑制了8-OHdG的增加(圖5，P<0.01)。與對照組比較， 450mOsm/L HS 下iHCEC細胞核中NRF2蛋白水平顯著增加，而與450mOsm/L HS比較，50μmol/L金雀異黃素預(yù)處理再于HS 450mOsm/L培養(yǎng)，NRF2蛋白水平也顯著增加(P<0.05，圖6)。檢測轉(zhuǎn)染siRNA后iHCEC細胞，與nc siRNA比較，在轉(zhuǎn)染NRF2 siRNA的細胞中NRF2 mRNA的表達水平顯著下降(P<0.01,圖7)。而金雀異黃素對IL-1β產(chǎn)生的抑制作用基本上被NRF2沉默所解除(P<0.05)。通過有關(guān)酶活性檢測發(fā)現(xiàn)， NRF2誘導(dǎo)其調(diào)節(jié)的抗氧化酶的表達。與對照組比較，450mOsm/L HS 下iHCEC細胞中SOD、Catalase和GR的活性顯著下降(P<0.01)，而50μmol/L金雀異黃素預(yù)處理顯著提高了其活性(圖8，P<0.01)。

圖4 CM-H2DCFDA探針檢測不同處理下iHCEC細胞內(nèi)ROS生成與對照組比較，*P<0.01；與450mOsm/L組比較，#P<0.01

圖5 免疫熒光染色檢測不同處理下iHCEC細胞中8-OHdG與對照組比較，*P<0.01；與450mOsm/L組比較，#P<0.01

圖6 Western blot法檢測不同處理下 iHCEC細胞中NRF2蛋白的表達水平與對照組比較，*P<0.05；與450mOsm/L組比較，#P<0.05

圖7 不同處理iHCEC細胞轉(zhuǎn)染 siRNA后NRF2 mRNA的表達水平與IL-1β分泌水平測定A.RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后iHCEC細胞中NRF2 mRNA的表達水平，與nc siRNA比較，*P<0.01;B.ELISA檢測iHCEC細胞中IL-1β的分泌水平，*P<0.05

圖8 不同處理iHCEC細胞中酶活性的檢測A.SOD檢測試劑盒檢測細胞中SOD含量；B.Catalase檢測試劑盒檢測細胞中Catalase含量；C.GR檢測試劑盒檢測細胞中GR含量；與對照組比較，*P<0.01；與450mOsm/L組比較，#P<0.01

討 論

角膜上皮屏障功能的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是緊密連接存在于頂層角膜上皮細胞之間，而干眼會引起角膜上皮細胞脫落[14]。治療干眼病的基本目標(biāo)是改善角膜上皮細胞的病理狀態(tài)，但引起這一病理改變的具體因素并不清楚。本研究通過實驗研究發(fā)現(xiàn)，高滲環(huán)境會導(dǎo)致人角膜上皮細胞活性降低，而金雀異黃素可以抑制HS誘導(dǎo)的人角膜上皮細胞活性下降，證明了金雀異黃素可以保護細胞免受HS誘導(dǎo)的損傷。

非感染性炎癥是干眼發(fā)病的重要因素。近年來關(guān)于淚腺、淚液以及結(jié)膜內(nèi)炎性細胞和炎性介質(zhì)等免疫因素的研究發(fā)現(xiàn)，多種類型干眼的淚腺組織、結(jié)膜組織以及淚液中T細胞增高，MHC-Ⅱ和 HLA-DR 陽性細胞增高，炎性因子 IL-1、TNF-α、MMP-9 等含量增高，均提示炎性因子在干眼發(fā)病中起重要作用[15]。炎性因子在角膜上皮細胞中高表達，參與免疫細胞向角結(jié)膜的聚集，導(dǎo)致了炎癥的不斷循環(huán)[16]。已有研究證明，在干眼相關(guān)的炎癥中ROS-NLRP3-IL-1β信號通路具有引發(fā)作用。HS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，特別是ROS的產(chǎn)生，已被認為是引發(fā)NLRP3炎性體激活的關(guān)鍵觸發(fā)因素，高滲刺激下可在15min內(nèi)迅速誘導(dǎo)HCEC產(chǎn)生ROS，隨后激活NLRP3導(dǎo)致pro-IL-1β mRNA和蛋白表達增加[8]。在本研究中，金雀異黃素預(yù)處理可以阻止了HS誘導(dǎo)的iHCEC和priHCEC細胞IL-1β分泌水平的增加，降低炎性體相關(guān)基因NLRP3、CASP1、IL1B和IL-18 mRNA的表達水平。在450mOsm/L HS 下iHCEC細胞內(nèi)ROS水平顯著增加，而用金雀異黃素預(yù)處理可以阻止ROS的升高。同樣，金雀異黃素預(yù)處理下顯著地抑制了iHCEC細胞中的另一種氧化應(yīng)激的生物學(xué)標(biāo)志物8-OHdG的增加。

NFR2 是內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白，可以抵抗氧化應(yīng)激的主要細胞的防御機制，保護其免受炎癥引起的氧化損傷。在氧化應(yīng)激條件下NFR2發(fā)生核轉(zhuǎn)位，與抗氧反應(yīng)元件結(jié)合，啟動抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄從而發(fā)揮抗氧化的保護作用[17]。本研究表明，iHCEC細胞中NRF2蛋白水平在金雀異黃素預(yù)處理下較450mOsm/L HS 下仍增加，而通過轉(zhuǎn)染NRF2 siRNA發(fā)現(xiàn)，金雀異黃素對IL-1β分泌產(chǎn)生的抑制作用基本上被NRF2沉默所解除，由此說明金雀異黃素的作用可能是通過激活NFR2來實現(xiàn)的。若 Nrf2 缺失或存在激活障礙，則會進一步加重細胞的氧化性損傷和炎性損傷，導(dǎo)致細胞生理功能障礙，最后甚至導(dǎo)致細胞凋亡或壞死，還可導(dǎo)致與氧化應(yīng)激和炎癥相關(guān)的疾病的發(fā)生[18]。本研究中iHCEC細胞在450mOsm/L HS刺激后，金雀異黃素顯著促進了細胞核中NRF2表達，而同時NRF2誘導(dǎo)了幾種抗氧化酶(SOD、Catalase和GR)的表達，且在金雀異黃素作用下這幾種抗氧化酶的活性均升高。由此證明了金雀異黃素可以通過激活NRF2抗氧化劑來消除HS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。

綜上所述，本研究表明，金雀異黃素可以保護HS誘導(dǎo)的人角膜上皮細胞的損傷，這種保護作用是通過激活NRF2抗氧化劑來抑制ROS-NLRP3-IL-1β信號通路實現(xiàn)的，并且誘導(dǎo)NRF2轉(zhuǎn)運至細胞核，增強了幾種抗氧化酶的活性。金雀異黃素可能會抑制HS誘導(dǎo)的細胞炎癥的啟動階段，并具有在較早階段預(yù)防和減輕與干眼相關(guān)的角膜炎癥的潛在能力。