張 波 王琳萍

2000年人類基因組測序完成標(biāo)志著分子醫(yī)學(xué)的新時(shí)期，新時(shí)期的醫(yī)學(xué)發(fā)展趨勢主要為基因檢測和分子治療?；蛑委燁I(lǐng)域的科學(xué)家在改善基因?qū)雲(yún)f(xié)同和載體方面付諸了大量的努力，新思路、新技術(shù)和新方法層出不窮。目前，關(guān)于基因?qū)胼d體有兩大主流：一是非病毒載體系統(tǒng)，劣勢為安全性差；二是病毒載體系統(tǒng)，劣勢為轉(zhuǎn)染低效性。納米醫(yī)學(xué)技術(shù)的產(chǎn)生和發(fā)展為提高非病毒性載體的轉(zhuǎn)染率帶來了曙光。非病毒載體和人工載體的深入研究將成為基因治療的重要策略。

一、基因治療及超聲靶向微泡破壞技術(shù)概述

1.基因治療：基因治療是將外源性基因?qū)氩∽兘M織，從功能上取代有缺陷的基因或產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)。目前已成功應(yīng)用于多種遺傳病以及獲得性疾病的臨床前研究試驗(yàn)，包括腫瘤、神經(jīng)退行性疾病和心血管疾病[1]。

2.納米級超聲造影劑：隨著對細(xì)胞和組織特異性分子標(biāo)記理解的進(jìn)步，功能化微泡也得到了發(fā)展，目前用于靶向分子成像的研究。當(dāng)微泡暴露在超聲波下時(shí)，它們會(huì)發(fā)生體積振蕩，并再次輻射出二次聲響應(yīng)，其振幅明顯高于同等大小的剛性球體產(chǎn)生的散射。因此，它們比紅細(xì)胞產(chǎn)生更強(qiáng)的回聲，使它們能夠作為血池(blood pool)試劑使用。此外，即使在中等超聲壓力下，微泡振蕩也可能是高度非線性的，由此產(chǎn)生的輻射信號中的諧波含量可用于實(shí)現(xiàn)更高的組織對比度[2]。

超聲造影劑已由游離微泡(用于右心系統(tǒng)顯像)、包裹空氣的微泡、包裹氟碳類氣體的微泡發(fā)展到了包裹惰性氣體的靶向性超聲造影劑(targeted ultrasound contrast agents，tUCAs)，tUCAs可分為微米級tUCAs和納米級tUCAs(一般為450～700nm)，通常認(rèn)為直徑<700nm的超聲造影劑可以通過腫瘤組織的高通透性及滯留效應(yīng)(即EPR效應(yīng))實(shí)現(xiàn)血管外成像。

目前，納米級超聲造影劑根據(jù)成膜材料主要分為以下3類:(1)高分子聚合物類：以多于 4個(gè)碳原子為全氟烷液體形式作為內(nèi)核，且以聚合物和天然大分子為主，包括聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)、聚 L-乳酸(PLLA)、聚己內(nèi)酯(PCL) 等，其優(yōu)點(diǎn)是易于制備、粒徑均一、穿透力和穩(wěn)定力強(qiáng)，適用于延遲成像和聚集顯像，通過修飾和改性可實(shí)現(xiàn)藥物緩釋，是目前報(bào)道最多的一種納米級超聲造影劑。但需要較強(qiáng)的超聲能量才能使其發(fā)生有效的振動(dòng)，這可能引發(fā)細(xì)胞溶解、毛細(xì)血管破裂等不良生物反應(yīng)。(2)脂質(zhì)類：納米脂泡造影劑為內(nèi)含惰性氣體成分(包括氟碳?xì)怏w或者氟硫氣體)，外為脂質(zhì)成分構(gòu)成的聲學(xué)造影劑，在超聲激勵(lì)下增強(qiáng)效率較低，但氣體包裹率高，多用于攜帶靶向藥物治療和基因轉(zhuǎn)染；納米級脂質(zhì)造影劑是在制備脂質(zhì)體的基礎(chǔ)上進(jìn)行改造，使其內(nèi)部含有許多小的氣體囊泡，常用的包括飽和與不飽和的磷脂酸、磷脂酰膽堿、乙醇胺和膽固醇等，以及包括一些化學(xué)成分(如生物素、熒光和聚乙二醇等)修飾后的對應(yīng)物質(zhì)。超聲顯像效果介于上述兩種納米級超聲造影劑之間，適用于遞送藥物和多模態(tài)顯像，安全無毒，可用于臨床。(3)無機(jī)納米材料類：二氧化硅及納米金等，具有良好的組織相容性、生物穩(wěn)定性及較高的反應(yīng)活性，可用于多模態(tài)成像，實(shí)現(xiàn)對腫瘤的診療一體化。

3.超聲靶向微泡破壞技術(shù)：超聲與微泡不僅能夠進(jìn)行聲學(xué)成像，還可以實(shí)現(xiàn)基因與藥物的靶向遞送。在活體內(nèi)，將靶向微泡偶聯(lián)或包載基因/藥物，在特定部位發(fā)射不同聲強(qiáng)的超聲波，達(dá)到基因/藥物的定點(diǎn)釋放，當(dāng)超聲強(qiáng)度足夠大時(shí)血液中的微泡發(fā)生破裂，通過產(chǎn)生微射流、沖擊波使周圍的血管壁或細(xì)胞膜表面出現(xiàn)可逆的或不可逆的穿孔，使血管內(nèi)皮屏障損傷，進(jìn)而增加血管通透性，增加外源性物質(zhì)到達(dá)特定部位的劑量，從而發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)。UTMD的可能機(jī)制包括空化效應(yīng)及其二級效應(yīng)、內(nèi)吞作用與聲輻射力及活性氧促Ca2+內(nèi)流等方面[3]。UTMD所產(chǎn)生的空化效應(yīng)和致死性聲孔效應(yīng)可直接導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生裂解死亡，這為UTMD直接治療腫瘤提供了理論依據(jù)。

4.基因傳遞系統(tǒng)：基因轉(zhuǎn)染技術(shù)系統(tǒng)包括病毒傳遞系統(tǒng)和非病毒傳遞系統(tǒng)。以病毒為載體時(shí)基因轉(zhuǎn)染率雖高但安全性差，且易引起機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。Carlo等[4]開發(fā)了一種基因轉(zhuǎn)移方法，該方法結(jié)合了脂質(zhì)包裹的全氟化碳微泡和超聲波來保護(hù)人類腺病毒并將其傳遞至目標(biāo)組織。以質(zhì)粒、脂質(zhì)體等非病毒為載體的基因轉(zhuǎn)染，雖具有生物安全性和成本效率優(yōu)勢，但轉(zhuǎn)染率低、靶向性差，存在適用范圍受限和有創(chuàng)等缺點(diǎn)。Zhang等[5]開發(fā)了一種新型殼聚糖結(jié)合的脂質(zhì)微泡，它具有良好的生物相容性和較高的基因負(fù)載能力，結(jié)合UTMD可促進(jìn)安全高效的基因體外轉(zhuǎn)染和體內(nèi)靶向基因傳遞的潛力。

二、UTMD在腫瘤基因治療中的應(yīng)用

靶向微泡作為載體與UTMD聯(lián)合，不僅保留了UTMD非侵入性、可重復(fù)性、時(shí)空靶點(diǎn)特異性、低免疫原性和毒性的優(yōu)點(diǎn)，還可進(jìn)一步增強(qiáng)傳遞的靶向性并改善UTMD難以控釋的不足。1998 年，Price等首次報(bào)道了UTMD與納米粒在活體動(dòng)物模型上的聯(lián)合應(yīng)用。2008年，Lentacker等首次報(bào)道UTMD成功介導(dǎo)載基因納米粒的轉(zhuǎn)染，該研究表明聚乙二醇化納米粒可保護(hù)核酸免受核酸酶的影響，從而實(shí)現(xiàn)超聲靶向基因或siRNA的遞送。

從本質(zhì)上來講，腫瘤是一種基因病，其發(fā)生、發(fā)展與復(fù)發(fā)均與基因的變異、缺失、畸形相關(guān)。隨著人類基因組計(jì)劃的順利實(shí)施和完成，以及新的人類疾病基因的發(fā)現(xiàn)和克隆，腫瘤的基因治療已成為備受矚目的研究領(lǐng)域并初步取得令人振奮的成果，針對腫瘤的特異性分子靶點(diǎn)設(shè)計(jì)腫瘤治療方案，是腫瘤靶向治療中最有前景的方案。

UTMD在腫瘤組織中的應(yīng)用較為成熟，在導(dǎo)致人類死亡的重要疾病實(shí)體腫瘤中，新生成的腫瘤微血管的內(nèi)皮細(xì)胞之間存在間隙，管壁的最大孔徑為380～780nm，因此，部分粒徑較小的納米超聲造影劑穿透腫瘤血管壁，實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的靶向顯像和治療。在微泡表面裝配上對腫瘤新生血管內(nèi)皮具有特異識別能力的分子探針，構(gòu)建成腫瘤的特異性載基因/藥超聲靶向微泡，可高效地靶向結(jié)合于腫瘤血管內(nèi)皮，對腫瘤進(jìn)行早期診斷，結(jié)合UTMD技術(shù)可提高腫瘤治療的特異性和靶向性。

微泡作為超聲造影劑的發(fā)展為超聲在臨床中的應(yīng)用開辟了新道路，同時(shí)也提供了眾多探索新興領(lǐng)域的研究機(jī)會(huì)。一些實(shí)驗(yàn)開發(fā)的應(yīng)用已經(jīng)應(yīng)用于臨床實(shí)踐，歐洲聯(lián)盟已經(jīng)發(fā)布了關(guān)于它們的使用指南，特別是在肝臟中。近年來， UTMD聯(lián)合載基因納米粒已在多種腫瘤的細(xì)胞與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中獲得了良好的治療效果，包括肝癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、腎細(xì)胞癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、膠質(zhì)瘤、鱗狀細(xì)胞癌等(表1)。UTMD聯(lián)合納米粒在心血管疾病、視網(wǎng)膜疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療領(lǐng)域也展現(xiàn)出了一定的潛力[6～10]。

三、展 望

超聲靶向微泡破壞技術(shù)在腫瘤治療中已成為一種新型的基因/藥物傳遞方法，且取得了許多積極的治療效果。然而目前研究多停留于細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，缺乏應(yīng)用于大型動(dòng)物模型的相關(guān)報(bào)道，在向臨床轉(zhuǎn)化的道路上尚有許多問題有待解決，如腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程、UTMD介導(dǎo)物質(zhì)傳遞、超聲對納米粒的作用以及納米粒如何解離的機(jī)制尚未明確；優(yōu)化參數(shù)的過程較為復(fù)雜；超聲微泡的應(yīng)用存在安全問題，除微泡在血液循環(huán)中可能引起微栓塞和毒性外，空化效應(yīng)的潛在危險(xiǎn)性也不容忽視，以上問題均限制了臨床前實(shí)驗(yàn)的推廣性，故當(dāng)前的研究主要關(guān)注提高基因轉(zhuǎn)染效率及改善靶向性、生物相容性、提升負(fù)載量、多模態(tài)成像等方面。有研究者制備了經(jīng)PEI-600修飾并涂有iRGD肽和抗CCR-2抗體的雙靶向陽離子微泡(MBiRGD/CCR-2)，該微泡具有良好的穩(wěn)定性、包載率及靶向性，具有促進(jìn)基因轉(zhuǎn)染的潛在價(jià)值。近年來出現(xiàn)了大量關(guān)于磁性微泡發(fā)展的研究，Chertok等[27]將肝素化的磁性納米顆粒偶聯(lián)到蛋白功能化的微泡表面，制備了具有強(qiáng)磁性和聲學(xué)活性的循環(huán)穩(wěn)定磁性微泡(MagMB)，MagMB在循環(huán)系統(tǒng)中可以避開肺的截留，并且磁靶向可使其積聚在腫瘤血管內(nèi)，通過超聲監(jiān)測并在需要時(shí)通過超聲進(jìn)行破壞。在此基礎(chǔ)上，通過對磁聲信號的實(shí)時(shí)監(jiān)測，可以調(diào)整磁聲靶向藥物以增強(qiáng)其靶向性。Li等[28]構(gòu)建了MBs@CS/PB/DNA的多功能基因傳遞體系，通過光熱療法與UTMD協(xié)同增效基因轉(zhuǎn)染。結(jié)果表明，MBs@CS/PB/DNA在體內(nèi)外均能顯著增強(qiáng)超聲成像效果，表現(xiàn)出優(yōu)異的生物相容性，使其有望進(jìn)一步探索成為超聲成像、光熱治療、藥物遞送、基因治療的聯(lián)合平臺(tái)。Liu等[29]成功制造了多功能葉酸靶向和載氧/吲哚菁綠脂質(zhì)納米顆粒(FA-OINPs)，用于卵巢癌細(xì)胞和皮下異種移植模型的雙模式成像引導(dǎo)治療，F(xiàn)A-OINPs被證明是極具潛力的超聲和光聲(US/PA)成像造影劑，可增強(qiáng)US/PA的體內(nèi)外成像能力。結(jié)果提示在US/PA雙模成像的指導(dǎo)下，光動(dòng)力/光熱介導(dǎo)的FA-OINPs為卵巢癌的協(xié)同治療提供了一種有前途的策略。

表1 UTMD在腫瘤基因治療中的應(yīng)用

綜上所述，高效表達(dá)載體和適用于臨床的基因轉(zhuǎn)移方法是決定基因治療成功的基礎(chǔ)。優(yōu)勢互補(bǔ)的多模態(tài)成像與診療一體化在綜合評價(jià)腫瘤診療方面能夠發(fā)揮巨大作用，是超聲靶向微泡破壞技術(shù)運(yùn)用于腫瘤基因診療中的必然發(fā)展趨勢。隨著超聲靶向微泡破壞技術(shù)和基因治療技術(shù)的深入研究，相關(guān)作用機(jī)制將會(huì)逐漸明確，可以預(yù)期UTMD聯(lián)合基因治療腫瘤技術(shù)最后的成功，將使其更好地服務(wù)于臨床，對醫(yī)學(xué)界產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。