李萬(wàn)里

(開(kāi)封市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 開(kāi)封 475000)

阿爾茨海默病是一種起病隱匿的進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退化疾病。臨床上主要以記憶障礙、失認(rèn)、失語(yǔ)、失用為主要表現(xiàn)特征[1]。65歲以前的發(fā)病者，稱為早老性癡呆；六十五歲以后的發(fā)病者，稱為老年性癡呆[2]。目前，阿爾茨海默病已經(jīng)成為威脅人們健康的重大疾病之一，其發(fā)病率和致殘率高的特點(diǎn)嚴(yán)重影響著人們的健康生活[3]。血清miR-19b-3p是一種具有調(diào)控因素表達(dá)作用的非編碼小分子，可穩(wěn)定存在于人體的血清中[4]。越來(lái)越多的研究表明通過(guò)檢測(cè)血清中minRNA的種類、數(shù)量，可以反映機(jī)體的生理狀況和疾病種類[5]。本研究主要是通過(guò)分析阿爾茨海默病大鼠的血清miRNA表達(dá)譜，再篩選出差異表達(dá)基因，在大鼠及細(xì)胞中高表達(dá)miRNA后，研究大鼠的認(rèn)知能力及細(xì)胞中BACE1蛋白的水平，為阿爾茨海默病大鼠的治療提供一定的臨床參考價(jià)值，現(xiàn)研究報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選用上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司的大鼠，鼠齡為8～12 w，體質(zhì)量為200～300 g，采用隨機(jī)提取和分籠培養(yǎng)的方法將其培養(yǎng)在室溫21～26 ℃，濕度60%～70%的環(huán)境中；(2)分組采樣：選取阿爾茨海默病大鼠32例作為觀察組，其中雄性大鼠18例，雌性大鼠14例。非阿爾茨海默病大鼠32例作為對(duì)照組，其中雄性大鼠16例，雌性鼠16例。采集血液10 mL，置于溫度4 ℃、轉(zhuǎn)速3000 r/min、半徑3 cm的環(huán)境中，離心10 min，將收集到的血清放置于Eppendorf管，保存于-80 ℃的環(huán)境中；(3)細(xì)胞及細(xì)胞株培養(yǎng)：選用中科院上海細(xì)胞庫(kù)的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤，將其培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，室溫37 ℃，CO25%的環(huán)境中。

1.2 方法

1.2.1 提取RNA

采用Trizol提取血清樣品總RNA，然后對(duì)其進(jìn)行Illumina/Solexa測(cè)序。實(shí)驗(yàn)中采用Illumina HiSeq2500測(cè)序儀(深圳華大基因科技有限公司)對(duì)患有阿爾茨海默病的觀察組和體檢健康的對(duì)照組進(jìn)行高通量測(cè)序。首先，將miRNA文庫(kù)連接到Illumina公司的芯片上，進(jìn)行固相橋梁擴(kuò)增法，經(jīng)過(guò)30輪的擴(kuò)增后，使其成為單克隆簇。其次，應(yīng)用邊合成邊測(cè)序的原理進(jìn)行enomeAna-lyzer系統(tǒng)測(cè)序。最后，將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)移到自動(dòng)分析通道進(jìn)行二次分析。

1.2.2 大鼠建模

通過(guò)無(wú)菌生理鹽水將Aβ1-40稀釋成2 μg/μL的狀態(tài)，在室溫37 ℃的環(huán)境下培養(yǎng)1 w的時(shí)間，將其轉(zhuǎn)變成聚焦?fàn)顟B(tài)的Aβ。將10%的水合氯醛經(jīng)腹腔注射到大鼠的體內(nèi)來(lái)麻醉大鼠。將大鼠頭頂部的毛發(fā)進(jìn)行剔除，暴露出大鼠的顱骨，根據(jù)前囟進(jìn)行定位，旁開(kāi)2.6 mm，后開(kāi)3.0 mm，下開(kāi)3.0 mm，在大鼠的顱骨上用牙鉆開(kāi)兩個(gè)對(duì)稱的小孔作為海馬區(qū)的注射點(diǎn)。用針挑破大鼠的硬腦膜，注射5 μL的Aβ-40于雙側(cè)海馬區(qū)域，并在10 min內(nèi)注射完成，留針10 min后再緩慢撤針。對(duì)照組大鼠注射等量的生理鹽水，其余的操作過(guò)程和觀察組相同。最后，將針孔用牙托粉進(jìn)行填補(bǔ)，縫合前采用慶大霉素進(jìn)行消毒處理，手術(shù)后采用單籠飼養(yǎng)的方法將大鼠飼養(yǎng)至完全清醒。

1.2.3 水迷宮實(shí)驗(yàn)

利用隨機(jī)數(shù)表法將60只大鼠分為4組，分別為正常組、阿爾茨海默病組、阿爾茨海默病聯(lián)合miR-19b-3p組和阿爾茨海默病聯(lián)合Vector組，每組為15只大鼠。正常組大鼠大腦的雙側(cè)海馬區(qū)給予注射生理鹽水。阿爾茨海默病組大鼠的Aβ蛋白注射為癡呆模型，大鼠大腦的雙側(cè)海馬區(qū)注射Aβ。阿爾茨海默病聯(lián)合miR-19b-3p組大鼠尾靜脈注射miR-19b-3p的慢性毒質(zhì)粒。阿爾茨海默病聯(lián)合Vector組大鼠尾靜脈注射空載質(zhì)粒。4組大鼠注射后4 d進(jìn)行定向航行實(shí)驗(yàn)，7 d進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)。大鼠開(kāi)始入水時(shí)，將其面向水池壁緩慢的投放到水中，在2 min之內(nèi)大鼠沒(méi)有找到平臺(tái)，通過(guò)人將其引導(dǎo)到平臺(tái)上進(jìn)行休息30 s，結(jié)束本次的訓(xùn)練。若大鼠在2 min之內(nèi)可以自行找到平臺(tái)，讓其在平臺(tái)上進(jìn)行休息30 s，結(jié)束本次的訓(xùn)練。不同方向的訓(xùn)練時(shí)間間隔為60 s，在訓(xùn)練的過(guò)程中進(jìn)行視頻拍攝和全程跟蹤。

1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法將合成的miR-19b-3p模擬劑和抑制劑轉(zhuǎn)染到SH-SY5Y的細(xì)胞系中，將其分別作為模擬組和抑制組，而沒(méi)有采用細(xì)胞轉(zhuǎn)染的SH-SY5Y的細(xì)胞系為無(wú)轉(zhuǎn)染組。隨后選取復(fù)蘇后傳代3次以上培養(yǎng)的SH-SY5Y細(xì)胞，等待細(xì)胞密度增至50%～70%時(shí)，將其培養(yǎng)基更換為無(wú)血清無(wú)雙抗培養(yǎng)基，利用jetPRIME轉(zhuǎn)染試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，待轉(zhuǎn)染5 h后將其培養(yǎng)基更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.5 Western blot檢測(cè)BACE1蛋白表達(dá)

通過(guò)提取轉(zhuǎn)染后SH-SY5Y細(xì)胞的總蛋白，經(jīng)BCA試劑盒(碧云天公司，中國(guó))檢測(cè)模擬組、抑制組和無(wú)轉(zhuǎn)染組的蛋白濃度。將變性后的蛋白樣品上樣經(jīng)過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(濃縮膠45 V，分離膠100 V)后，將其轉(zhuǎn)到PVDF膜(Millipore公司，美國(guó))上，PVDF膜采用5%的脫脂奶粉的1×TBST(1×TBST中加入0.2%的Tween-20)，在室溫4 ℃的環(huán)境下進(jìn)行密封過(guò)夜。其中，1×TBST一共洗膜4次，共40 min，一抗BACE1(1∶1000稀釋，Epitomics公司，美國(guó))室溫4 ℃下進(jìn)行培養(yǎng)過(guò)夜，1×TBST洗膜后。二抗辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG(1∶1000稀釋，Goat-anti Mouse HRP-IgG，碧云天公司，中國(guó))室溫孵育1 h，經(jīng)過(guò)1×TBST洗膜后，采用ECL試劑盒進(jìn)行顯色、顯影和定影處理。同一張膜抗體的洗脫以后，將檢測(cè)GAPDH蛋白條進(jìn)行檢測(cè)，最后作為內(nèi)參。

1.3 觀察指標(biāo)

(1)觀察組相比于對(duì)照組高通量測(cè)序后的miRNAs水平；(2)miR-19b-3p對(duì)阿爾茨海默病大鼠認(rèn)知功能的影響；(3)SH-SY5Y細(xì)胞中BACE1蛋白濃度的表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。觀測(cè)數(shù)據(jù)主要是計(jì)量資料，正態(tài)計(jì)量資料的多組間比較采用單因素方差分析，多重比較為HSD-q檢驗(yàn)。偏態(tài)資料的組間比較為秩檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 高通量測(cè)序結(jié)果—miRNAs水平比較

兩組樣本均經(jīng)高通量測(cè)序，所獲miRNAs水平資料見(jiàn)表1。由其知，觀察組相比于對(duì)照組而言，血清中miR-146a-5p、miR-195-5p、miR-20b-5p水平上調(diào)(P<0.05)。miR-125b-3p、miR-19b-3p水平下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 兩組高通量測(cè)序后的miRNAs水平比較(n=15)

注：本表“倍數(shù)K[ Log2(AD /Control)]”=算術(shù)倍數(shù)值的以2為底的對(duì)數(shù)值，即算術(shù)倍數(shù)=2K

2.2 miR-19b-3p對(duì)阿爾茨海默病大鼠認(rèn)知功能的影響水平

整體比較(單因素方差分析)知：整體組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。多重比較并結(jié)合主要數(shù)據(jù)分析：阿爾茨海默病組或阿爾茨海默病聯(lián)合Vector組與正常組相比，逃避潛伏期明顯增加(P<0.05)。阿爾茨海默病聯(lián)合miR-19b-3p組與阿爾茨海默病組相比，逃避潛伏期明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。數(shù)據(jù)及詳細(xì)的比較結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3 SH-SY5Y細(xì)胞中BACE1蛋白濃度的表達(dá)水平

仿前做整體比較，整體組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。多重比較并結(jié)合主要數(shù)據(jù)分析：模擬組相比于無(wú)轉(zhuǎn)染組SH-SY5Y細(xì)胞中BACE1蛋白濃度明顯減少(P<0.05)。抑制組相比于無(wú)轉(zhuǎn)染組SH-SY5Y細(xì)胞中BACE1蛋白濃度明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。數(shù)據(jù)及詳細(xì)的比較結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 miR-19b-3p對(duì)阿爾茨海默病大鼠認(rèn)知功能的影響水平

注：a表示與正常組相比，P<0.05；b表示與阿爾茲海默病組相比，P<0.05；c表示與阿爾茲海默病聯(lián)合Vecter組相比，P<0.05

表3 SH-SY5Y細(xì)胞中BACE1蛋白濃度的表達(dá)水平

注：a表示與無(wú)傳統(tǒng)組相比，P<0.05；b表示與模擬組相比，P<0.05

3 討 論

阿爾茨海默病是一種常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，發(fā)病時(shí)伴隨的臨床特征主要有記憶力下降、認(rèn)知能力下降、生活自理能力下降等[6]。目前，對(duì)于阿爾茨海默病的發(fā)病原因尚不明確，但根據(jù)已經(jīng)掌握的資料顯示，阿爾茨海默病與大腦的炎性反應(yīng)有著重要的關(guān)聯(lián)[7]。miRNA是一種在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控基因表達(dá)的非編碼小分子RNA，大小約為20～25個(gè)核苷酸[8]。成熟的miRNA是由較長(zhǎng)的初級(jí)轉(zhuǎn)錄物經(jīng)過(guò)一系列的核酸酶的剪切加工而產(chǎn)生的，隨后組裝進(jìn)入RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體中，通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式識(shí)別出靶mRNA，并根據(jù)互補(bǔ)程度的不同指導(dǎo)沉默復(fù)合體降解靶mRNA或者阻止靶mRNA進(jìn)行翻譯[9-10]。在人體內(nèi)miRNA的數(shù)量及指標(biāo)的異常還可以促進(jìn)或延緩EMT，也與腫瘤的轉(zhuǎn)移和預(yù)后有很大的關(guān)聯(lián)[11]。因此，可以通過(guò)檢測(cè)血清中miRNA的數(shù)量、種類，達(dá)到檢測(cè)反應(yīng)機(jī)體生理狀況是否正常的目的。

本文通過(guò)研究血清miR-19b-3p對(duì)阿爾茨海默病認(rèn)知水平，來(lái)進(jìn)一步探究其作用效果。本研究結(jié)果表明，觀察組相比于對(duì)照組而言，血清中miR-146a-5p、miR-195-5p、miR-20b-5p水平上調(diào)，而miR-125b-3p、miR-19b-3p水平下調(diào)。其結(jié)果表明，阿爾茨海默病的發(fā)生與這五種差異表達(dá)基因有著重大的聯(lián)系，其中miR-146a-5p、miR-195-5p、miR-20b-5p和miR-125b-3p均有文獻(xiàn)報(bào)道[12]，認(rèn)為其可以作為阿爾茨海默病的生物標(biāo)志，而miR-19b-3p尚無(wú)相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道，需要進(jìn)一步挑選miR-19b-3p作為研究對(duì)象在動(dòng)物細(xì)胞上進(jìn)行研究。阿爾茨海默病組或阿爾茨海默病聯(lián)合Vector組與正常組相比，逃避潛伏期明顯增加。其結(jié)果表明，大鼠建模成功，可以進(jìn)一步分析轉(zhuǎn)染后SH-SY5Y細(xì)胞中BACE1的蛋白濃度。阿爾茨海默病聯(lián)合miR-19b-3p組與阿爾茨海默病組相比，逃避潛伏期明顯減少。其結(jié)果表明，miR-19b-3p與阿爾茨海默病的表現(xiàn)有著密切的聯(lián)系，miR-19b-3p可以作為阿爾茨海默病的生物標(biāo)志，并且高表達(dá)水平的miR-19b-3p可以改善阿爾茨海默病大鼠的認(rèn)知能力。模擬組相比于無(wú)轉(zhuǎn)染組SH-SY5Y細(xì)胞中BACE1蛋白濃度明顯減少，抑制組相比于無(wú)轉(zhuǎn)染組SH-SY5Y細(xì)胞中BACE1蛋白濃度明顯增加。其結(jié)果表明，在SH-SY5Y細(xì)胞中BACE1的表達(dá)可以被miR-19b-3p進(jìn)行負(fù)向的調(diào)控，表明BACE1可能是miR-19b-3p的靶細(xì)胞，血清miR-19b-3p可通過(guò)干預(yù)BACE1的表達(dá)來(lái)改善阿爾茨海默病大鼠的認(rèn)知功能。

綜上所述，miR-19b-3p可能會(huì)通過(guò)調(diào)節(jié)BACE1的表達(dá)來(lái)參與阿爾茨海默病的形成，通過(guò)干預(yù)BACE1的表達(dá)還可以改善阿爾茨海默病大鼠的認(rèn)知功能，可以為今后阿爾茨海默病的治療提供一定的臨床參考。