李樹，師超，郭宇姝

(解放軍總醫(yī)院醫(yī)療保障中心藥劑科，北京 100048)

人參皂苷Rb1是人參中的主要活性成分之一，具有多種藥理活性，如神經(jīng)保護(hù)作用、防護(hù)應(yīng)激損傷、抑制腫瘤細(xì)胞、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等［1–3］。以往研究已有關(guān)于使用高效液相色譜–紫外檢測(HPLC–UV)和液相色譜–質(zhì)譜(LC–MS)以及液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜(LC–MS／MS)技術(shù)，測定服用人參皂苷混合物或含人參的中藥方劑(如參麥注射液和開心散)后GRb1成分的藥代動力學(xué)行為的報道［4–7］。但中藥成分復(fù)雜，組分間存在相互作用，會影響GRb1的代謝動力學(xué)行為［8］。有人對服用GRb1單體后的代謝動力學(xué)進(jìn)行了研究［9］，但定量限較高，為20 ng／mL［10］?？蛋驳龋?1］采用梯度洗脫，單個樣品的分析時間較長。在上述報道中，樣品預(yù)處理均采用常規(guī)方法。考慮到代謝動力學(xué)研究過程中，常規(guī)的樣品預(yù)處理手段在處理大量生物樣品時效率較低，而基于96 孔板的樣品預(yù)處理技術(shù)可以明顯提高樣品處理的效率和通量［12］。因此筆者應(yīng)用基于96 孔板的高效血漿樣品處理手段，采用LC–MS／MS 法測定大鼠血漿中人參皂苷Rb1的含量，方法快速、靈敏，將其應(yīng)用于大鼠口服人參皂苷Rb1后的代謝動力學(xué)研究。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜儀：Agilent 1260 型，美國安捷倫科技有限公司；

三重四級桿質(zhì)譜儀：6410 型，美國安捷倫科技有限公司；

高速低溫離心機：GTR16-2 型，北京時代北利離心機有限公司；

96 孔板系統(tǒng)：美國瓦里安公司；

渦旋振蕩器：VORTEX 4 型，德國IKA 公司；電子分析天平：BT–25 S 型，感量為0.000 01 g，德國Sartourious 公司；

超純水系統(tǒng)：Milli-Q 型，美國密理博公司；

人參皂苷Rb1對照品：純度為98%，批號為J1229008，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

人參皂苷Rg1對照品：純度大于98%，批號為I1228039，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

甲醇、乙腈、甲酸：色譜純，德國默克公司；

SD 大鼠：體重270～320 g，雌雄各半，合格證號：SCXK(京)2009–0007，北京華阜康生物科技股份有限公司；

實驗所用其它試劑均為分析純。

1.2 儀器工作譜條件

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent SB–C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，3.5 μm，美國安捷倫科技有限公司)；流動相：甲醇–0.1%甲酸溶液(體積比為75∶25)；流量：0.2 mL／min；進(jìn)樣體積：5 μL。

1.2.2 質(zhì)譜條件

采用電噴霧正離子模式；毛細(xì)管電壓：3.5 kV；干燥氣：N2，流量為11 L／min；干燥氣溫度：350℃；檢測離子對：人參皂苷Rb1(m／z 1 131.5 →365.1)，內(nèi)標(biāo)人參皂苷Rg1(m／z 823.3 →643.4)；碰撞電壓：60 eV(人參皂苷Rb1)，40 eV(人參皂苷Rg1)。

1.3 溶液配制

精密稱取10.0 mg 人參皂苷Rb1，置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至標(biāo)線，得到質(zhì)量濃度為1 mg／mL 的人參皂苷Rb1儲備液。精密移取Rb1儲備液適量，配成20，40，100，300，1 000，3 000，10 000 ng／mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。將人參皂苷Rb1的工作溶液，用空白血漿進(jìn)行稀釋得到人參皂苷Rb1質(zhì)量濃度分別為1，2，5，15，50，150，500 ng／mL 的系列血漿標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。質(zhì)控樣品依照相同的方法進(jìn)行稀釋配制，人參皂苷Rb1的質(zhì)量濃度分別為2，20，400 ng／mL。

精密稱取10.0 mg 內(nèi)標(biāo)人參皂苷Rg1，置于10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至標(biāo)線，得到1 mg／mL的人參皂苷Rg1儲備液，精密移取Rg1儲備液適量，配成200 ng／mL 的內(nèi)標(biāo)工作溶液。

1.5 血漿樣品預(yù)處理

血漿樣品的預(yù)處理在96 孔板上結(jié)合8 道移液器完成。將100 μL 系列血漿標(biāo)準(zhǔn)工作溶液、空白血漿樣品、質(zhì)控樣品等分別加入到96 孔板中，并加入內(nèi)標(biāo)工作溶液5 μL(空白血漿樣品除外)，渦旋混合30 s 后，加入0.1 mol／L 的NaOH 溶液10 μL，渦旋混勻。在上述溶液中加入正丁醇0.5 mL，振搖提取2 min，在2 000 r／min 轉(zhuǎn)速下離心10 min后，于–20℃冷凍1 h，移取上層有機溶劑0.4 mL 至另一板中，于45℃下用氮氣吹干，用100 μL 流動相復(fù)溶后進(jìn)樣分析。

1.6 藥代動力學(xué)實驗

6 只大鼠，雌雄各半，禁食過夜，灌胃給予5 mg／kg 的人參皂苷Rb1。于給藥前及給藥后0.25，0.5，0.75，1，2，3，4，6，8，10，12，24，36，48，72 h，眼眶取血約0.3 mL，置于肝素化的離心管中，離心分取血漿，于–20℃下保存。所得的血藥濃度–時間數(shù)據(jù)以非房室模型計算藥代動力學(xué)參數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 液相色譜–質(zhì)譜條件優(yōu)化

在液相色譜條件優(yōu)化過程中，綜合考慮分離度、色譜峰對稱性、保留時間等因素，圍繞流動相組成及甲酸、乙酸等添加劑的種類及含量展開，最終確定以甲醇–0.1%甲酸溶液(體積比為75∶25)為流動相。通過比較人參皂苷Rb1和內(nèi)標(biāo)在正、負(fù)兩種離子檢測方式下的響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)兩種待測成分在正離子模式下的響應(yīng)明顯優(yōu)于負(fù)離子模式，因此選擇正離子模式。通過對人參皂苷Rb1和內(nèi)標(biāo)進(jìn)行一級質(zhì)譜全掃描發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rb1和內(nèi)標(biāo)的準(zhǔn)分子離子峰［M+Na］+分別為m／z 1 131.5 和 m／z 823.3。采用儀器自帶的Masshunter Optimizer (Version B.04.01)軟件進(jìn)行二級碎片的掃描和優(yōu)化，最終確定人參皂苷Rb1和內(nèi)標(biāo)的定量離子反應(yīng)分別為1 131.5 →365.1，823.3 →643.4，最優(yōu)碰撞電壓分別為60，40 eV。圖1 為人參皂苷Rb1和內(nèi)標(biāo)的一／二級質(zhì)譜圖。

圖1 人參皂苷Rb1(A)和內(nèi)標(biāo)(B)的一／二級質(zhì)譜圖

2.2 方法專屬性

在選擇提取溶劑時，對液–液萃取過程中有機溶劑的組分進(jìn)行考察。比較了正丁醇、乙酸乙酯以及二者不同比例混合液作為提取溶劑時對血漿樣品提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)的影響，發(fā)現(xiàn)正丁醇提取回收率高，基質(zhì)效應(yīng)少，因此最終采用正丁醇作為提取溶劑。將5 個不同個體的大鼠血漿及標(biāo)準(zhǔn)添加血漿按1.5 進(jìn)行血漿樣品預(yù)處理，色譜圖見圖2。如圖2 所示，人參皂苷Rb1和內(nèi)標(biāo)的保留時間分別為1.8 min 和1.3 min，血漿中的內(nèi)源性成分不干擾目標(biāo)成分的出峰位置。

圖2 大鼠血漿中的人參皂苷Rb1 和內(nèi)標(biāo)人參皂苷Rg1 的色譜圖

2.3 線性方程、線性范圍和定量限

通過測定大鼠血漿中人參皂苷Rb1的標(biāo)準(zhǔn)曲線上的濃度點，以人參皂苷Rb1與內(nèi)標(biāo)的峰面積之比(y)對濃度(x)進(jìn)行線性回歸，以1／x 為加權(quán)系數(shù)。測得人參皂苷Rb1的線性范圍為1～500 ng／mL，回歸方程為y=0.053 96x+0.004 045，r2=0.999 5，定量限為1 ng／mL。精密度為8.2%，準(zhǔn)確度為113.4%。對于濃度超出線性范圍的血漿樣品，用空白血漿進(jìn)行10 倍稀釋后并重新測定，對稀釋效應(yīng)進(jìn)行考查，發(fā)現(xiàn)10 倍稀釋后，對測定結(jié)果的準(zhǔn)確性沒有影響。

2.4 準(zhǔn)確度和精密度試驗

通過測定低、中、高3 個濃度的質(zhì)控樣品，計算大鼠血漿中人參皂苷Rb1的批內(nèi)和批間精密度和準(zhǔn)確度，結(jié)果見表1。

表1 批內(nèi)和批間精密度和準(zhǔn)確度試驗結(jié)果

2.5 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)

提取回收率反映了生物樣品中目標(biāo)化合物的提取效率，是評價生物樣品分析方法的重要指標(biāo)之一［13］?；|(zhì)效應(yīng)是指在LC–MS／MS 分析測定中，色譜分離時共洗脫物可能影響目標(biāo)化合物的離子化效率，引起信號抑制或增強。生物樣品中存在大量內(nèi)源性物質(zhì)，因此在對生物樣品進(jìn)行LC–MS／MS分析測定時，必須對基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行系統(tǒng)地考察［14］。通常有兩種方法評價基質(zhì)效應(yīng)：柱后灌流法［15］和標(biāo)準(zhǔn)添加法［16］。設(shè)置低、中、高3 個濃度考察提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)。低、中、高3 個濃度的大鼠血漿質(zhì)控樣品測得的色譜峰面積為M1；空白血漿樣品經(jīng)提取后加入對應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液測得的色譜峰面積為M2；對應(yīng)濃度純標(biāo)準(zhǔn)品溶液測得的色譜峰面積為M3；計算回收率為M1與M2的比值，基質(zhì)效應(yīng)為M2與M3的比值。結(jié)果表明，人參皂苷Rb1在低、中、高三個濃度的回收率分別為80.3%，81.0%，79.7%，基質(zhì)效應(yīng)為96.6%，99.3%，99.3%；內(nèi)標(biāo)人參皂苷Rg1的回收率為83.1%，基質(zhì)效應(yīng)為91.4%。證明該方法提取回收率良好，基質(zhì)干擾效應(yīng)小，符合生物樣品分析方法的要求。

2.6 穩(wěn)定性

穩(wěn)定性是指在確定條件下，一定時間內(nèi)待測物在給定基質(zhì)中的化學(xué)穩(wěn)定性。按照《藥物非臨床藥代動力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》(2014 年5 月頒布)和《中華人民共和國藥典》(2015 年版)附錄中生物樣品定量分析方法指導(dǎo)原則的規(guī)定，在方法學(xué)驗證過程中，需要對分析樣品的穩(wěn)定性進(jìn)行考察。穩(wěn)定性研究主要考察了低、中、高3 個濃度的QC 樣品在室溫25℃放置4 h、樣品經(jīng)預(yù)處理后置于自動進(jìn)樣器8 h、–20℃冷凍條件放置30 天、以及3 次凍融循環(huán)后的穩(wěn)定性，結(jié)果如表2 所示。結(jié)果表明，大鼠血漿樣品中人參皂苷Rb1在不同條件下的穩(wěn)定性良好，符合生物樣品分析方法的要求。

表2 大鼠血漿樣品中人參皂苷Rb1 在不同條件下的穩(wěn)定性

2.7 大鼠灌胃人參皂苷Rb1 后的代謝動力學(xué)研究

大鼠單次灌胃給予5 mg／kg 的人參皂苷Rb1后的平均血藥濃度時間曲線見圖3。用DAS 2.0 軟件以非房室模型計算代謝動力學(xué)參數(shù)。結(jié)果顯示，人參皂苷Rb1在大鼠體內(nèi)血藥濃度的達(dá)峰時間tmax為1.53 h，半衰期t1／2為13.54 h，MRT 為26.22 h，AUC0～24為16 237.76 (ng·h)／mL。

圖3 大鼠口服5 mg／kg 人參皂苷Rb1 后的血藥濃度–時間曲線

3 結(jié)語

應(yīng)用96 孔板系統(tǒng)對大鼠血漿中的人參皂苷Rb1進(jìn)行液液萃取，實現(xiàn)多個樣品同時處理，可以在一塊孔板上完成隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線，增加了樣品處理的平行性，提高了樣品處理效率；采用等度洗脫，單個樣品的分離時間為3 min。通過對分析方法進(jìn)行優(yōu)化及系統(tǒng)的方法學(xué)驗證，最終確定定量下限為1 ng／mL。該方法具有快速、高效、靈敏等特點，適用于人參皂苷Rb1在大鼠體內(nèi)的代謝動力學(xué)研究。