魏敏，周劍，柴艷兵，張耀廣，李飛，李興佳，李會會，李雙

(1.君樂寶乳業(yè)集團(tuán)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部乳品質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石家莊 050021；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081)

近幾年，毒素污染在食品安全問題中不斷出現(xiàn)，嚴(yán)重危害了人們的生活及健康。生物毒素，又稱天然毒素，是指來源于生物且不可自復(fù)制的有毒化學(xué)物質(zhì)［1–3］。黃曲霉毒素M1 是哺乳動(dòng)物攝入被黃曲霉毒素B1 污染的飼料后在體內(nèi)代謝的產(chǎn)物［4–6］。黃曲霉毒素M1 性質(zhì)穩(wěn)定，耐酸堿的同時(shí)也耐高溫［7–8］，因此被污染的生牛乳可直接導(dǎo)致嬰幼兒配方奶粉及乳粉中黃曲霉毒素M1 含量超標(biāo)［9］。因此能夠準(zhǔn)確可靠地檢測黃曲霉毒素M1 的含量是一項(xiàng)重要工作。1993 年，黃曲霉毒素被世界衛(wèi)生組織癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定為一類天然存在的致癌物，是毒性極強(qiáng)的劇毒物質(zhì)。2017 年，世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)將公布的致癌物清單進(jìn)行初步整理，黃曲霉毒素M1 被列于2B 類致癌物清單中，常見于牛吃了被霉菌污染的飼料后所產(chǎn)生的牛奶。我國的GB 2761–2017《 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素限量》規(guī)定，乳及乳制品中黃曲霉毒素M1 的限量指標(biāo)為0.5 μg／kg。歐盟的規(guī)定更加嚴(yán)格［10］，限量指標(biāo)為0.05 μg／kg，黃曲霉毒素M1 的檢測方法很多，主要有熒光分光光度法、酶聯(lián)免疫法［11］、免疫層析檢測方法［12］、高效液相色譜法、薄層色譜分析法、液相色譜–質(zhì)譜聯(lián)用法等［13–15］。2016 年國家制定了GB 5009.24–2016《 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中黃曲霉毒素M 族的測定》。為確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，需要具有溯源性的高準(zhǔn)確度的黃曲霉毒素M1 殘留基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為日常質(zhì)控方式。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)JJF1342–2012 《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制(生產(chǎn))機(jī)構(gòu)通用要求》［16］和JJF1343–2012《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)的原理》［17］以及其它標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制技術(shù)規(guī)范［18］，采用牛給藥飼喂方式獲得陽性樣品，采用多家實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合定值，并根據(jù)JJF1059–1999 《測量不確定度評定與表示》進(jìn)行了不確定度評估。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜儀：Agilent 1200 型，美國安捷倫科技有限公司；

質(zhì)譜儀：API3500 型，美國AB Sciex 公司；

氮吹儀：TTL–DCII 型，北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司；

黃曲霉毒素免疫親和柱：中國Agela Technologies公司；

黃曲霉毒素M1 (AFTM1)溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：編號為GBW(E)100419a，10.5 μg／mL，不確定度為0.5 μg／mL，浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院；

黃曲霉毒素M1 同位素標(biāo)記溶液(13C17–AFTM1)：編號為GBW(E)100419a，0.504 μg／mL，不確定度為0.008 μg／mL，浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院；

乙腈、甲醇、正己烷、甲酸：HPLC 級，德國Merck 公司；

乙酸銨、氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀、鹽酸等：分析純，中國國藥試劑有限公司。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜

色譜柱：Shiseido CAPCELL C18柱(150 mm×2.1 mm，1.7 μm，美國賽默飛世爾公司)；流動(dòng)相：A 為5 mmol／L 乙酸銨溶液，B 為50%乙腈–50%甲醇溶液，流量為0.30 mL／min，梯度洗脫見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.2.2 質(zhì)譜

離子源：電噴霧正離子(ESI+)監(jiān)測模式，多重反應(yīng)監(jiān)測(MRM)掃描模式；離子源噴射電壓：4.5 kV；溫度：550 ℃；駐留時(shí)間：200 ms；霧化氣壓力(GS1)：344.75 kPa；輔助氣壓力(GS2)：344.75 kPa；氣簾氣壓力(CUR)：241.325 kPa。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值方法

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品用甲醇提取，以免疫親和柱提取凈化，采用液相色譜–同位素稀釋質(zhì)譜法(LC–ID–MS／MS)在1.2 儀器工作條件對乳粉中黃曲霉毒素M1 進(jìn)行定值。

樣品前處理方法：稱取乳粉(1 g，精確至0.001 g)于50 mL 離心管中，準(zhǔn)確加入100 μL 濃度為5 ng／mL 黃曲霉毒素M1 同位素標(biāo)記(13C17–AFTM1)工作液，加50℃純凈水4 mL，充分渦旋混勻，靜置平衡30 min。然后加入10 mL 甲醇，渦旋提取3 min，在4℃下以6 000 r／min 離心10 min，取10 mL上清液于潔凈50 mL 離心管中，加入PBS 緩沖液稀釋。將上述樣液過免疫親和柱，上樣后加10 mL 水淋洗，淋洗后用真空泵抽干親和柱，用2 mL 乙腈洗脫親和柱，重復(fù)洗脫步驟一次，真空泵抽干后，用氮?dú)獯蹈?，? mL 68%乙酸銨+32%乙腈甲醇溶液定容，過0.22 μm 濾膜，上機(jī)分析。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備

通過目標(biāo)成分量范圍確定，給藥飼喂奶牛，通過15 天監(jiān)控黃曲霉毒素M1 殘留含量，最終對黃曲霉毒素M1 含量在0.2～0.3 μg／kg 的生乳樣品進(jìn)行取樣，取樣后將生乳混合、均質(zhì)、凍干、二次混合，用避光鋁箔袋封裝，按5 g／袋包裝，共包裝150 個(gè)單元，進(jìn)行輻照實(shí)驗(yàn)，–80℃冷凍保存。

1.5 均勻性和穩(wěn)定性檢驗(yàn)

1.5.1 均勻性檢驗(yàn)

按照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制的技術(shù)規(guī)范［19］，從已經(jīng)分裝好的黃曲霉毒素M1 基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中隨機(jī)抽取11個(gè)單元，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性檢驗(yàn)。檢驗(yàn)方法與基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值方法相同，每袋重復(fù)測定3 次。

1.5.2 穩(wěn)定性檢驗(yàn)

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性試驗(yàn)包括長期穩(wěn)定性試驗(yàn)和短期穩(wěn)定性試驗(yàn)，長期穩(wěn)定性考察采用LC–ID–MS／MS 分別在第0，1，2，3，6 個(gè)月進(jìn)行長期穩(wěn)定性試驗(yàn)，每次選取2 個(gè)包裝單元，每個(gè)包裝單元，平行測定3 次。

短期穩(wěn)定性試驗(yàn)根據(jù)模擬運(yùn)輸過程中的數(shù)據(jù)進(jìn)行考察，將樣品置于4℃(冰箱)條件下，分別在0，1，3，5，7 天進(jìn)行穩(wěn)定性監(jiān)測，測定方法與1.3 基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值方法相同。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)聯(lián)合定值

聯(lián)合6 家實(shí)驗(yàn)室按1.3 定值方法進(jìn)行定值。

2 結(jié)果與討論

2.1 均勻性檢驗(yàn)分析

對隨機(jī)抽取的11 個(gè)單元進(jìn)行測定，對均勻性檢驗(yàn)結(jié)果做方差比率檢驗(yàn)（F 檢驗(yàn)），通過比較組內(nèi)方差和組間方差的比值與臨界值的大小，判斷基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)有無系統(tǒng)性差異，結(jié)果見表2、表3。

表2 乳粉中黃曲霉毒素M1 殘留標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性檢驗(yàn)結(jié)果 μg／kg

表3 方差分析結(jié)果

查表得F0.05(10，22)=2.75，乳粉中黃曲霉毒素M1殘留標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的F 計(jì)算值為2.019，F(xiàn) ＜F0.05(10，22)，說明在95%的置信區(qū)間乳粉中黃曲霉毒素M1 殘留標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品均勻性良好。

2.2 穩(wěn)定性檢驗(yàn)

按照1.5.2 對黃曲霉毒素M1 殘留基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分別進(jìn)行長期穩(wěn)定性和短期穩(wěn)定性試驗(yàn)，結(jié)果見表4。采用直線模型作為經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，以時(shí)間x 為縱坐標(biāo)、黃曲霉毒素M1 測定值Y 為橫坐標(biāo)，對乳粉中黃曲霉毒素M1 殘留基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)長期穩(wěn)定性獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

表4 乳粉中黃曲霉毒素M1 殘留標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)長期穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果

在6 個(gè)月的長期穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中，乳粉中黃曲霉毒素M1 殘留基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)擬合直線斜率可用下式計(jì)算：

自 由 度 為n–2 和95% 置 信 水 平 的t 因 子 t0.95，n–2=3.18。t0.95,3s(β1)=3.18×0.030 48=0.096 93。

因?yàn)閨β1|=0.022 2，|β1|

短期穩(wěn)定性同樣采用趨勢分析進(jìn)行考察，將樣品置于4℃(冰箱)模擬運(yùn)輸條件下，分別在第0，1，3，5，7 天進(jìn)行檢測測，測定方法與1.3 定值方法相同，結(jié)果見表5。

表5 乳粉中黃曲霉毒素M1 殘留標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)短期穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果

由表5 可知，4℃(冰箱)模擬運(yùn)輸條件下乳粉中黃曲霉毒素M1 殘留基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)擬合直線斜率為|β|=0.011 5，|β|

2.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)聯(lián)合定值結(jié)果

乳粉中黃曲霉毒素M1 殘留基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)6 家實(shí)驗(yàn)室定值結(jié)果見表6。

表6 乳粉中黃曲霉毒素M1 殘留標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值結(jié)果 μg／kg

(1)正態(tài)檢驗(yàn)。對表5 數(shù)據(jù)進(jìn)行達(dá)戈斯提諾正態(tài)分布檢驗(yàn)，D 值為0.279 7 大于臨界值0.275 7，因此，該組數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布。

(2)異常值檢驗(yàn)。根據(jù)狄克遜檢驗(yàn)表，r1和rn均小于?(0.05，54)=0.32，故全部數(shù)據(jù)均應(yīng)保留。

(3)等精度檢驗(yàn)。根據(jù)科克倫檢驗(yàn)準(zhǔn)則，計(jì)算統(tǒng)計(jì)量6 組方差和為0.122，其中最大方差為0.210，計(jì)算得C=0.2102／0.122=0.361 5，查表得C(0.05，6，9)=0.3817，C ＜C(0.05，6，9)，表明各組數(shù)據(jù)平均值間為等精度。

因此本標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)乳粉中黃曲霉毒素M1 定值結(jié)果為6 家實(shí)驗(yàn)室測定結(jié)果的總平均值：2.446 μg／kg。

2.4 不確定度評定

對于乳粉中黃曲霉毒素M1 殘留基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，其定值結(jié)果的不確定度組為(1)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不均勻性引入的不確定度；(2)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不穩(wěn)定性引入的不確定度；(3)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值引入的不確定度。

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不均勻性引入的不確定度ubb,rel

不均勻引入性的不確定度分量ubb主要來源于樣品加工過程不均勻性、分裝不均勻性以及平行實(shí)驗(yàn)分析間的偏差，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不均勻性以獨(dú)立測定平行實(shí)驗(yàn)來表示，即以瓶間和瓶內(nèi)均勻性檢驗(yàn)結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差sH表示。

式中：MSamong——組間均方差，來自表3；

MSwithin——組內(nèi)均方差，來自表3。

則均勻性檢驗(yàn)引入的相對不確定度：

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不穩(wěn)定性引入的不確定度ults,rel

由表4 穩(wěn)定性檢驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果可知，長期穩(wěn)定性檢驗(yàn)引入的不確定度：

短期穩(wěn)定性引入的不確定度：

黃曲霉毒素M1 乳粉基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)長期性穩(wěn)定引入的相對不確定度：

短期穩(wěn)定性引入的相對不確定度：

合成得黃曲霉毒素M1 乳粉基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性引入的不確定度：

2.4.3 定值引入的不確定度

本實(shí)驗(yàn)采用液相色譜–同位素稀釋質(zhì)譜法，其他合作定值單位也采用同上方法獨(dú)立測量。經(jīng)柯克倫檢驗(yàn)和迪克遜檢驗(yàn)數(shù)據(jù)無異常值，最終定值結(jié)果為6 家實(shí)驗(yàn)室的合作定值結(jié)果，將這6 組實(shí)驗(yàn)室的平均值作為一組新的數(shù)據(jù)，則定值引入的不確定度：

定值引入的相對不確定度：

乳粉中黃曲霉毒素M1 殘留基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值結(jié)果的合成相對不確定度：

k=2 時(shí)，相對擴(kuò)展不確定度：

擴(kuò)展不確定度：

2.5 定值結(jié)果

乳粉中黃曲霉毒素M1 殘留分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值結(jié)果：(2.45±0.41) μg／kg，k=2。

3 結(jié)語

研制了乳粉中黃曲霉毒素M1 殘留基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。通過牛飼喂方式獲得乳粉中黃曲霉毒素M1 陽性樣品，采用液相色譜–質(zhì)譜聯(lián)用同位素稀釋內(nèi)標(biāo)法對樣品中的黃曲霉毒素M1 進(jìn)行定量檢測。選擇了乙腈中黃曲霉毒素M1 標(biāo)準(zhǔn)溶液GBW(E)100419(a)，保證了奶粉中黃曲霉毒素M1量值測量的可靠、可溯源。采用13C17–黃曲霉毒素M1 標(biāo)準(zhǔn)溶液作為穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)，進(jìn)行了均勻性檢驗(yàn)和穩(wěn)定性考察，并對研制過程進(jìn)行了不確定度評估。該基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)獲批為國家二級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，可為我國乳品質(zhì)量安全檢測提供有力的技術(shù)支撐，對乳制品保障質(zhì)量安全具有重要的意義。