曹進(jìn)喜，李強(qiáng)，谷輝

(威海市計(jì)量所，山東威海 264200)

除蟲(chóng)脲的化學(xué)分子式為C14H9ClF2N2O2，屬苯甲?；交孱悮⑾x(chóng)劑，主要是胃毒和觸殺作用，能夠抑制昆蟲(chóng)生長(zhǎng)需要的幾丁聚糖合成或使其快速降解，使昆蟲(chóng)幼體蛻皮過(guò)程受到限制，停止發(fā)育而致死［1–3］。該產(chǎn)品具有低毒特性，并能有效地防治對(duì)有機(jī)磷、有機(jī)氯有抗性的害蟲(chóng)，因而被廣泛用于蔬菜、瓜果、糧棉油作物、茶葉、園林等的害蟲(chóng)防治。

隨著人們對(duì)食品安全意識(shí)的日益加強(qiáng)，農(nóng)藥殘留監(jiān)控也受到越來(lái)越多的關(guān)注［4–10］。由于該類農(nóng)藥對(duì)人類存在潛在危險(xiǎn)，世界各個(gè)國(guó)家都非常重視，并相繼制定嚴(yán)格的殘留農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)，美國(guó)國(guó)家環(huán)境保護(hù)部門發(fā)布相關(guān)技術(shù)文件，規(guī)定了除蟲(chóng)脲在系列產(chǎn)品中的殘留限制含量，國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)生委發(fā)布實(shí)施的食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中規(guī)定了食品中除蟲(chóng)脲的最大殘留量為20 mg／kg。

目前測(cè)定果蔬中苯甲酰脲類農(nóng)藥的色譜方法主要有高效液相色譜法、液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法、超高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法和氣相色譜–質(zhì)譜法等。采用上述方法進(jìn)行藥物殘留分析，需要將待測(cè)組分與基體進(jìn)行分離，然后選擇合適的分析手段完成檢測(cè)，由于處理步驟復(fù)雜，選擇溶劑多樣，各家數(shù)據(jù)存在一定差別，為了使測(cè)試數(shù)據(jù)更加準(zhǔn)確可靠，必須采用相同溶劑基體的同類農(nóng)藥溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)測(cè)試儀器進(jìn)行校準(zhǔn)，采用建立工作曲線的方式，使測(cè)試方法得到優(yōu)化。

筆者選用國(guó)家有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為起始物料，通過(guò)稱量、溶解、分裝、密封等操作過(guò)程，制備了丙酮中除蟲(chóng)脲溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，制備過(guò)程嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)室溫度、濕度，以及漂浮于空氣中的雜質(zhì)等，使用器具均符合國(guó)家檢定計(jì)量要求，確保該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)量值準(zhǔn)確、溯源可靠。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜儀：Agilent-1260 型，配可調(diào)波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器，美國(guó)Agilent 公司；

電子天平：AB204–N 型，分度值為0.000 1 g，瑞士METTLER–TOLEDO 公司；

容量瓶：500 mL，A 級(jí)，經(jīng)檢定合格后使用；

分裝注射器：Dosys174 型，瑞士SOCOREX 公司；

分裝容器：2 mL 安瓿瓶，美國(guó)Agilent 公司；

除蟲(chóng)脲純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：編號(hào)為GBW(E) 060893，純度為99.8%，相對(duì)擴(kuò)展不確定度為0.6%(k=2)，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院；

丙酮：色譜純，美國(guó)Thermo Fisher(中國(guó))有限公司。

1.2 基本制備流程

首先根據(jù)實(shí)際需求，進(jìn)行除蟲(chóng)脲溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的配方設(shè)計(jì)。對(duì)預(yù)用溶劑及除蟲(chóng)脲純物質(zhì)理化性質(zhì)進(jìn)行綜合分析：除蟲(chóng)脲純品為白色晶體，對(duì)光源、熱源比較穩(wěn)定，可以在常溫下穩(wěn)定貯存，在常用有機(jī)溶劑丙酮中的溶解度為6.5 g／L，經(jīng)過(guò)理論計(jì)算，滿足設(shè)計(jì)需求。

通過(guò)定量溶解方式制備丙酮中除蟲(chóng)脲溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

采用方差分析法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，通過(guò)組間方差與組內(nèi)方差的比較來(lái)判定丙酮中除蟲(chóng)脲溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性。

采用直線擬合的統(tǒng)計(jì)方法，對(duì)丙酮中除蟲(chóng)脲溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)短時(shí)間內(nèi)對(duì)非正常儲(chǔ)存溫度和較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)常溫貯存的穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)估。

從配制容器、溫度、原料、使用天平、除蟲(chóng)脲丙酮溶液的均勻性及穩(wěn)定性等各個(gè)方面分別進(jìn)行合理的不確定度評(píng)定。

綜上，丙酮中除蟲(chóng)脲溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的基本制備流程見(jiàn)圖1。

圖1 丙酮中除蟲(chóng)脲溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的基本制備流程

1.3 色譜條件

色 譜 柱：SB–C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美國(guó)Agilent 公司)，流動(dòng)相：甲醇–水(體積比為85∶15)；檢測(cè)波長(zhǎng)：300 nm；流量：1.0 mL／min；進(jìn)樣體積：20 μL。

2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

為避免空氣中灰塵等的影響，配制過(guò)程在超凈室中進(jìn)行，并保持溫度為(20±2)℃。

(1)定量溶解。準(zhǔn)備潔凈干燥的燒杯，直接以燒杯為稱量容器，準(zhǔn)確稱取除蟲(chóng)脲0.050 1 g，向燒杯中加入適量丙酮，待完全溶解。

(2)準(zhǔn)確定容。將已經(jīng)完全溶解的除蟲(chóng)脲丙酮溶液轉(zhuǎn)移至500 mL 容量瓶中，再用丙酮定容，并且反復(fù)上下顛倒搖勻。

(3)密封分裝。將裝有標(biāo)準(zhǔn)溶液的容量瓶、連續(xù)分液注射器及分裝安瓿瓶(2 mL)通過(guò)軟管密閉連接，定量分裝，每瓶為1 mL 裝量，共460 瓶，并保持低溫封口，整個(gè)過(guò)程避免了溶劑揮發(fā)，確保標(biāo)準(zhǔn)溶液特性量值的準(zhǔn)確。

(4)保存。依次將分裝后標(biāo)準(zhǔn)溶液編號(hào)并粘貼標(biāo)簽，放置于避光、陰涼的地方貯存。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液中除蟲(chóng)脲的檢測(cè)

采用液相色譜法按1.3 色譜條件對(duì)丙酮溶劑和制備的丙酮中除蟲(chóng)脲溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定。丙酮溶劑色譜圖見(jiàn)圖2，丙酮中除蟲(chóng)脲溶液色譜圖見(jiàn)圖3。

圖2 丙酮溶劑色譜圖

由圖2 可知，丙酮保留時(shí)間為2.578 min，該丙酮試劑中不含除蟲(chóng)脲組分。

圖3 丙酮中除蟲(chóng)脲溶液色譜圖

由圖3 可知，丙酮保留時(shí)間為2.578 min，除蟲(chóng)脲保留時(shí)間為4.070 min。

3 結(jié)果與討論

3.1 均勻性檢驗(yàn)

依據(jù)JJF 1343–2012 的規(guī)定，樣品單元數(shù)為300時(shí)，抽樣量不少于15 個(gè)。按照隨機(jī)抽取的原則，從460 個(gè)分裝單元中抽取16 個(gè)單元(即16 瓶)進(jìn)行均勻性檢驗(yàn)。采用色譜法進(jìn)行分析，在相同條件下，每個(gè)單元平行測(cè)量3 次，記錄測(cè)量值，采用方差分析法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，通過(guò)組間方差與組內(nèi)方差的比較來(lái)判定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性［11–13］。

采用液相色譜法對(duì)丙酮中除蟲(chóng)脲溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，數(shù)據(jù)列于表1。按照均勻性檢驗(yàn)數(shù)據(jù)處理方法，自由度ν1=15，ν1=32，取給定的顯著性水平α=0.05，查表得F 臨界值為1.99。由表1 統(tǒng)計(jì)結(jié)果可知，總平均值為99.92 μg／mL。計(jì)算得組間差方和為5.75，組內(nèi)差方和為10.67，組間方差=0.38，組內(nèi)方差s22=0.33，計(jì)算得F實(shí)驗(yàn)值為1.15，

表1 均勻性檢驗(yàn)結(jié)果 μg／mL

小于查表所得F 臨界值1.99，從而可以判定分裝后的除蟲(chóng)脲標(biāo)準(zhǔn)溶液是均勻的。

3.2 穩(wěn)定性檢驗(yàn)

對(duì)已進(jìn)行均勻性檢驗(yàn)合格的標(biāo)準(zhǔn)溶液，需要進(jìn)行短期穩(wěn)定性和長(zhǎng)期穩(wěn)定性檢驗(yàn)。短期穩(wěn)定性評(píng)估主要是考察短時(shí)間內(nèi)非正常貯存溫度對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特性值的影響，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)溫度為50℃，時(shí)間為10 天，測(cè)試安排為每天連續(xù)測(cè)定，測(cè)試方法和測(cè)試儀器與均勻性檢驗(yàn)一致，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)量3 次，以平均值作為統(tǒng)計(jì)值，用回歸曲線法進(jìn)行穩(wěn)定性監(jiān)測(cè)結(jié)果的判斷。

除蟲(chóng)脲標(biāo)準(zhǔn)溶液的短期穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果列于表2。

表2 短期穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果

采用回歸曲線進(jìn)行穩(wěn)定性判斷是以測(cè)試時(shí)間T為橫坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液中除蟲(chóng)脲含量c 為縱坐標(biāo)建立數(shù)學(xué)模型，得到回歸曲線c=a+β1T，進(jìn)行t 檢驗(yàn)，即根據(jù)自由度查表得到t 臨界值，根據(jù)回歸曲線計(jì)算斜率β1的絕對(duì)值與斜率標(biāo)準(zhǔn)偏差的比值，該比值和t 臨界值進(jìn)行比較。通過(guò)表2 數(shù)據(jù)計(jì)算可得：斜率β1的絕對(duì)值為0.002，β1標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.019，兩者比值小于查表得到的t 臨界值(t=2.31)，表明回歸曲線斜率不顯著，在周期為10 天、高溫50℃的貯存條件下，沒(méi)有觀察到丙酮中除蟲(chóng)脲標(biāo)準(zhǔn)溶液量值的明顯不穩(wěn)定。

長(zhǎng)期穩(wěn)定性是考察在較長(zhǎng)周期內(nèi)正常保存條件下該溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特性值的穩(wěn)定性，測(cè)試時(shí)間安排按照前密后疏的原則，測(cè)試周期通常為13 個(gè)月，測(cè)試方法和測(cè)試儀器與均勻性檢驗(yàn)一致，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)量3 次，以平均值作為統(tǒng)計(jì)值，用回歸曲線法進(jìn)行穩(wěn)定性監(jiān)測(cè)結(jié)果的判斷。長(zhǎng)期穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果列于表3。

表3 長(zhǎng)期穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)表3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)計(jì)算可得：斜率β1的絕對(duì)值為0.042，β1標(biāo)準(zhǔn)偏差s(β1)為0.026，兩者比值小于查表得到的t 臨界值(t=2.31)，表明回歸曲線斜率不顯著，在較長(zhǎng)周期12 個(gè)月的正常貯存條件下，沒(méi)有觀察到丙酮中除蟲(chóng)脲標(biāo)準(zhǔn)溶液量值的明顯不穩(wěn) 定。

3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的定值

3.3.1 定值方法

丙酮中除蟲(chóng)脲溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是基于重量–容量法，通過(guò)定量溶解定容的方式配制得到。依據(jù)起始物料除蟲(chóng)脲質(zhì)量、純度和溶液最終定容體積，其特性量值按式(1)計(jì)算。

式中：c——丙酮中除蟲(chóng)脲的質(zhì)量濃度，μg／mL；

m——除蟲(chóng)脲純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)量，g；

w——除蟲(chóng)脲純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度，%；

V——標(biāo)準(zhǔn)溶液定容體積，mL。

經(jīng)過(guò)計(jì)算，丙酮中除蟲(chóng)脲溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值結(jié)果為100 μg／mL。

3.3.2 定值結(jié)果驗(yàn)證

為了進(jìn)一步證明上述制備的丙酮中除蟲(chóng)脲標(biāo)準(zhǔn)溶液量值準(zhǔn)確可靠，需要進(jìn)行特性量值比對(duì)。比對(duì)過(guò)程：以上述制備的標(biāo)準(zhǔn)溶液為標(biāo)準(zhǔn)，與國(guó)家二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW(E) 081501 丙酮中除蟲(chóng)脲溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(標(biāo)準(zhǔn)值為100 μg／mL，擴(kuò)展不確定度為2%)進(jìn)行量值測(cè)試結(jié)果比對(duì)，將測(cè)試結(jié)果比對(duì)誤差與標(biāo)準(zhǔn)溶液不確定度進(jìn)行比較，結(jié)果列于表4。由表4 結(jié)果可知，研制的溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與已經(jīng)批準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)水平相當(dāng)，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)采用稱量–容量法配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液，其量值是準(zhǔn)確可靠的。

表4 國(guó)內(nèi)除蟲(chóng)脲溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)比對(duì)分析結(jié)果 μg／mL

3.3.3 不確定度評(píng)定

從除蟲(chóng)脲丙酮標(biāo)準(zhǔn)溶液制備整體過(guò)程的每一環(huán)節(jié)逐一分析，科學(xué)判斷該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)總不確定度主要產(chǎn)生于以下幾個(gè)方面［14–15］：

(1)制備使用起始物料除蟲(chóng)脲純品引入的不確定度，根據(jù)標(biāo)物證書(shū)計(jì)算原料純度引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度up=0.6%／2=0.3%。

(2)稱量用電子天平的分度值0.000 1 g，稱量樣品m=50.1 mg，按照均勻分布，k 3= ，所以電子天平分度值引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

天平最大允許誤差為0.5 mg，稱量樣品m=50.1 mg，按照均勻分布，，所以電子天平最大允許誤差引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

合成得稱量過(guò)程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

(3)制備過(guò)程標(biāo)準(zhǔn)溶液定容是使用500 mL 的容量瓶，規(guī)格為A 級(jí)，最大允許誤差為±0.25 mL，按均勻分布考慮，，則容量瓶引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

(4)溶液配制環(huán)境溫度為(20±2)℃，丙酮體積膨脹系數(shù)為1.43×10–3／℃，按均勻分布考慮，，則由溫度變化引起的體積誤差引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

(5)根據(jù)均勻性測(cè)試數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)計(jì)算表明，選擇色譜方法評(píng)估該標(biāo)準(zhǔn)溶液的均勻性重復(fù)性良好，所以由均勻性影響因素對(duì)定值結(jié)果引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

(6)通過(guò)穩(wěn)定性測(cè)量結(jié)果統(tǒng)計(jì)，該溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在12 月內(nèi)正常保存條件下特性量值的不穩(wěn)定性是不明顯的，所以由穩(wěn)定性影響因素對(duì)定值結(jié)果引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

以上各個(gè)不確定分量均對(duì)定值結(jié)果有一定影響，而且彼此之間互不相關(guān)，則合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

取包含因子k=2，則相對(duì)擴(kuò)展不確定度：

研制的丙酮中除蟲(chóng)脲溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值結(jié)果為100 μg／mL，相對(duì)擴(kuò)展不確定度為2%(k=2)。

4 結(jié)論

(1)基于稱量–容量法以分步定量溶解方式制備的丙酮中除蟲(chóng)脲溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，除蟲(chóng)脲濃度量值滿足均勻性F 檢驗(yàn)和穩(wěn)定性t 檢驗(yàn)，與國(guó)家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測(cè)試結(jié)果比對(duì)，量值符合技術(shù)要求。

(2)制備的除蟲(chóng)脲丙酮溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可用于測(cè)定果蔬、茶葉、土壤等中除蟲(chóng)脲類殘留農(nóng)藥日常分析與檢測(cè)，同時(shí)適用于相關(guān)方法評(píng)價(jià)、儀器工作曲線建立及校準(zhǔn)。