高青青 趙成群

712000 咸陽，陜西省咸陽市第一人民醫(yī)院腎內(nèi)科(高青青)；710016 西安，西安大興醫(yī)院腎內(nèi)科(趙成群)

糖尿病腎病(diabetes nephropathy，DN)是糖尿病患者經(jīng)常出現(xiàn)的微血管并發(fā)癥之一，會(huì)導(dǎo)致終末期腎臟病，嚴(yán)重時(shí)甚至可致死[1]，DN作為一種慢性疾病，初期表現(xiàn)為腎臟體積肥大、基底膜增厚、細(xì)胞外基質(zhì)積累等一系列病理變化，從而引起腎小球硬化、腎間質(zhì)纖維化，最終導(dǎo)致腎衰竭，目前臨床中尚沒有完全有效的治療方案[2]。DN的發(fā)病機(jī)理復(fù)雜，目前尚未被完全闡明，但高血糖被認(rèn)為是DN的公認(rèn)致病因素，高糖可誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞產(chǎn)生過量活性氧簇(reactive oxygen，ROS)，引起炎癥因子異常表達(dá)，導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷及嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，最終造成細(xì)胞外基質(zhì)的沉積[3-4]。作為傳統(tǒng)中草藥，白花丹具有祛風(fēng)、活血、化瘀、解毒等功效，白花丹消蠱湯對(duì)食蟹猴肝纖維化具有很好的抑制作用[5]，且其主要活性成分白花丹素可抑制腎小球系膜細(xì)胞增殖及促纖維化因子TGF-β1的表達(dá)[6]，因而推測(cè)白花丹提取物可能對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞分泌炎癥因子及細(xì)胞外基質(zhì)具有抑制作用。miR-155/SOSC1信號(hào)可介導(dǎo)炎癥因子的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控機(jī)體炎癥反應(yīng)。細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)抑制蛋白1(cytokine signal transduction inhibitor 1，SOCS1)是機(jī)體中主要的炎癥通路負(fù)調(diào)控蛋白，miR-155上調(diào)時(shí)，其表達(dá)下調(diào)，促使炎癥反應(yīng)增強(qiáng)[7]。抑制miR-155表達(dá)可上調(diào)SOCS-1表達(dá)，進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激損傷，因此miR-155/SOCS1信號(hào)通路可能是治療DN的一個(gè)突破口[8-9]。白花丹提取物對(duì)miR-155/SOCS1信號(hào)通路是否有調(diào)控作用，目前尚不清楚。本文通過高糖誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞分泌炎癥因子及細(xì)胞外基質(zhì)，探討白花丹提取物對(duì)其的影響及作用機(jī)制。

材料與方法

一、主要試劑及儀器

腎小球系膜細(xì)胞購(gòu)自廣州柏賽柯生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：RMC001；白花丹藥材購(gòu)自上海雅吉生物科技有限公司，貨號(hào)：121369-200401；miR-155、U6、SOCS1、GAPDH引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；DMEM低糖培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素混合液、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、PBS緩沖液、胰蛋白酶-EDTA消化液、D-葡萄糖粉購(gòu)自美國(guó)Solarbio公司，貨號(hào)分別為：31600、11011-8611、P1400、P1200-50T、P1022、T1300、G8150；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海鈺博生物科技有限公司，貨號(hào)：IC-SOD-Ra；丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海信裕生物科技有限公司，貨號(hào)：xy-30182；大鼠白細(xì)胞介素6(interleukin 6，IL-6)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)ELISA試劑盒、兔源GAPDH、纖維連結(jié)蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)、Ⅳ型膠原蛋白(collagen IV，Col IV)及SOCS1一抗、羊抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，貨號(hào)分別為：ab100772、ab100785、ab119558、ab2413、ab6586、ab181602、ab62584、ab150077；RNAiso Plus、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自日本Takara公司，貨號(hào)分別為：9108、RR037Q/A/B、639519；RIPA裂解液、BCA試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司，貨號(hào)分別為：P0013K、P0011等。XElx800酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Perkin Elmer公司；CFX96 Touch Deep Well熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；3900型高通量DNA合成儀購(gòu)自美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；1659001蛋白電泳儀、Trans-Blot SD半干轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；Centrifuge 5424R低溫高速離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf股份公司；IBright CL 1500凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；BSA224S-CW電子天平購(gòu)自北京六一儀器廠等。

二、方法

1.細(xì)胞模型制備及分組處理 分別采用以下方法制備完全培養(yǎng)基和高糖培養(yǎng)基。(1)完全培養(yǎng)基的配制：500 mL低糖DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基(含有5.6 mmol/L葡萄糖)中加入10%胎牛血清、100 U/mL青鏈霉素溶液，上下震蕩混勻即可。(2)高糖培養(yǎng)基的配制：完全培養(yǎng)基中加入D-葡萄糖粉，使葡萄糖終濃度為30 mmol/L，然后上下震蕩混勻即可。

將白花丹藥物切碎，置于蒸餾水中浸泡12 h以上，加熱煎煮30 min，冷卻后過濾取汁；將濾渣再煎煮2次，過濾取汁；將3次藥汁混合，濃縮制得100 mg/L的白花丹水提物備用，采用HPLC法檢測(cè)其中主要活性成分白花丹醌的量為0.05%[10]，以DMEM培養(yǎng)基稀釋白花丹水提物，過濾除菌后備用[6]。

腎小球系膜細(xì)胞在39 ℃水浴中快速解凍后復(fù)蘇，接種在25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5%CO2、95%濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%左右時(shí)，胰酶消化后，以1∶3的比例傳代培養(yǎng)。

參照文獻(xiàn)[11]，傳代培養(yǎng)的細(xì)胞接種在24孔板中，隨機(jī)分為對(duì)照組，模型組，白花丹提取物低、中、高劑量組，甘露醇組。對(duì)照組使用含有5.6 mmol/L葡萄糖的完全培養(yǎng)基，其它各組以含有30 mmol/L葡萄糖的高糖培養(yǎng)基誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞纖維化。給藥組分別以白花丹提取物低(1 mg/L)、中(2 mg/L)、高(4 mg/L)劑量處理細(xì)胞；甘露醇組以24.5 mmol/L的甘露醇[12]處理細(xì)胞。48 h后收集各組細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)基。

2.各組細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6及TGF-β1水平 取各組細(xì)胞培養(yǎng)基，3 000 r/min，4 ℃離心5 min，取上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)上清液中IL-6、TNF-α、TGF-β1水平，具體操作參照試劑盒說明書，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.各組細(xì)胞SOD及MAD水平檢測(cè) 取各組細(xì)胞加入蛋白裂解液在冰浴中裂解2 h，3 000 r/min，4 ℃離心20 min，取上清液，采用試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞SOD及MAD水平，具體操作參照說明書，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

4.各組細(xì)胞miR-155、SOCS1 mRNA檢測(cè) 取各組細(xì)胞參照說明書以RNAiso Plus提取總RNA，然后以逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以熒光定量PCR試劑盒對(duì)其進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系配制、反應(yīng)條件設(shè)定、具體操作按照各自的說明書進(jìn)行，以U6為miR-155的內(nèi)參基因，以GADPH為SOCS1的內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt算法分析所得數(shù)據(jù)，得出miR-155、SOCS1 mRNA水平相對(duì)表達(dá)量，各基因引物序列見表1。

表1 各基因引物序列

5.各組細(xì)胞中FN、Col IV、SOCS1蛋白表達(dá)檢測(cè) 取各組細(xì)胞以含有蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液在冰浴中裂解2 h，3 000 r/min，4 ℃離心20 min，取上清液即可得總蛋白樣品液，以BCA試劑盒測(cè)得各組總蛋白濃度，SDS-PAGE凝膠制備試劑盒配制適宜濃度的濃縮膠、分離膠，具體操作參照說明書，各組細(xì)胞分別取含相同質(zhì)量總蛋白的樣品液進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)移全部分離蛋白至PVDF膜上，加入5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后，根據(jù)目的蛋白分子量截取蛋白條帶，以相應(yīng)的一抗、二抗孵育后，以TBST漂洗3次，采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，使用凝膠成像系統(tǒng)拍照，以Quantity One軟件分析蛋白相對(duì)表達(dá)量。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、各組細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6、TGF-β1水平比較

與對(duì)照組相比，模型組、甘露醇組細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6、TGF-β1水平升高(P<0.05)。與模型組相比，白花丹提取物低、中、高劑量組細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6、TGF-β1水平降低(P<0.05)，TNF-α、IL-6、TGF-β1水平的降低程度對(duì)白花丹提取物呈劑量依賴性(P<0.05)。(表2)

表2 各組細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6、TGF-β1水平比較(n=3)

注：與對(duì)照組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05

二、各組細(xì)胞SOD、MDA水平比較

與對(duì)照組相比，模型組、甘露醇組細(xì)胞SOD水平明顯降低(P<0.05)，MDA水平升高(P<0.05)。與模型組相比，白花丹提取物低、中、高劑量組細(xì)胞SOD水平升高(P<0.05)，MDA水平降低(P<0.05)，SOD、MDA水平的變化程度對(duì)白花丹提取物呈劑量依賴性(P<0.05)。(表3)

表3 各組細(xì)胞SOD、MDA水平比較(n=3)

注：與對(duì)照組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05

三、各組細(xì)胞FN、Col IV蛋白表達(dá)量比較

與對(duì)照組相比，模型組、甘露醇組細(xì)胞FN、Col IV蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。與模型組相比，白花丹提取物低、中、高劑量組細(xì)胞FN、Col IV蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，F(xiàn)N、Col IV蛋白的降低程度對(duì)白花丹提取物呈劑量依賴性(P<0.05)。(圖1、表4)

四、各組細(xì)胞miR-155、SOCS1 mRNA表達(dá)量比較

與對(duì)照組相比，模型組、甘露醇組細(xì)胞miR-155表達(dá)升高(P<0.05)，SOCS1 mRNA表達(dá)降低(P<0.05)。與模型組相比，白花丹提取物低、中、高劑量組細(xì)胞miR-155表達(dá)降低(P<0.05)，SOCS1 mRNA表達(dá)升高(P<0.05)，miR-155、SOCS1 mRNA表達(dá)的變化程度對(duì)白花丹提取物呈劑量依賴性(P<0.05)。(表5)

注：A為對(duì)照組；B為模型組；C為白花丹提取物低劑量(1 mg/L)組；D為白花丹提取物中劑量(2 mg/L)組；E為白花丹提取物高劑量(4 mg/L)組；F為甘露醇(24.5 mmol/L)組圖1 各組細(xì)胞FN、Col IV蛋白免疫印跡檢測(cè)結(jié)果

表4 各組細(xì)胞FN、Col IV蛋白相對(duì)表達(dá)量比較(n=3)

注：與對(duì)照組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05

表5 各組細(xì)胞miR-155、SOCS1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較(n=3)

與對(duì)照組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05。

五、各組細(xì)胞SOCS1蛋白表達(dá)量比較

與對(duì)照組相比，模型組、甘露醇組細(xì)胞SOCS1蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。與模型組相比，白花丹提取物低、中、高劑量組細(xì)胞SOCS1蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，SOCS1蛋白表達(dá)的升高程度對(duì)白花丹提取物呈劑量依賴性(P<0.05)。(圖2、表6)

注：A為對(duì)照組；B為模型組；C為白花丹提取物低劑量(1 mg/L)組；D為白花丹提取物中劑量(2 mg/L)組；E為白花丹提取物高劑量(4 mg/L)組；F為甘露醇(24.5 mmol/L)組圖2 各組細(xì)胞SOCS1蛋白免疫印跡檢測(cè)結(jié)果

表6 各組細(xì)胞SOCS1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較(n=3)

注：與對(duì)照組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05

討 論

腎小球系膜細(xì)胞作為一種維持腎小球結(jié)構(gòu)和功能所必須的腎臟固有細(xì)胞，對(duì)腎小球血流、細(xì)胞因子的分泌、基質(zhì)代謝等生理過程均發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。DN發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前研究認(rèn)為患者機(jī)體因糖脂代謝紊亂導(dǎo)致的高糖可引起腎小球系膜細(xì)胞產(chǎn)生ROS、釋放多種細(xì)胞因子，繼而引發(fā)腎小球血液流變學(xué)改變、氧化應(yīng)激損傷及嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，使系膜細(xì)胞外基質(zhì)聚集，最終導(dǎo)致腎小球纖維化及腎功能衰退[13]。糖尿病發(fā)病過程中腎小球系膜細(xì)胞釋放的炎癥因子IL-6、TNF-α可導(dǎo)致嚴(yán)重的炎性反應(yīng)，在DN發(fā)病階段起著重要作用[14]；SOD是清除自由基的超氧化物歧化酶，MDA是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，兩者水平可反映組織細(xì)胞氧化應(yīng)激水平[15]；TGF-β1是作用最強(qiáng)的致纖維化細(xì)胞因子，腎臟固有細(xì)胞及炎細(xì)胞均可分泌，可促進(jìn)腎小球系膜細(xì)胞合成細(xì)胞外基質(zhì)，并促進(jìn)其沉積，最終導(dǎo)致腎小球硬化及腎臟纖維化[16]；FN和Col IV是構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分[17]。本文以30 mmol/L的葡萄糖誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞分泌炎癥因子及細(xì)胞外基質(zhì)，結(jié)果顯示模型組細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6及TGF-β1水平、細(xì)胞MDA水平、細(xì)胞FN及Col IV蛋白表達(dá)明顯升高，細(xì)胞SOD水平明顯降低，表明高糖可引起腎小球系膜細(xì)胞炎性反應(yīng)及氧化應(yīng)激損傷，促進(jìn)致纖維化因子釋放，增強(qiáng)細(xì)胞外基質(zhì)合成，并使其沉積，模型建立成功，甘露醇可以模擬高糖導(dǎo)致的高滲環(huán)境，結(jié)果顯示，甘露醇亦可引發(fā)腎小球系膜細(xì)胞氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致其細(xì)胞外基質(zhì)合成并沉積，但作用比高糖弱，表明高糖不僅可通過高滲透壓途徑引發(fā)腎小球系膜細(xì)胞分泌炎癥因子及細(xì)胞外基質(zhì)，還可通過其他途徑調(diào)控該過程。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為DN屬“水腫”、“消渴”范疇，主要證型為血瘀證。嶺南中藥白花丹可祛風(fēng)、散瘀、解毒，具有抗肝纖維化作用，其有效成分白花丹醌可抑制肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的失窗口化，降低血清中層黏連蛋白、Col IV水平，最終減輕肝纖維化程度[18-19]，因而本課題組推測(cè)白花丹提取物可能對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞分泌炎癥因子及細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生抑制作用。mir-155/SOSC1是調(diào)控機(jī)體炎癥反應(yīng)的重要信號(hào)通路，miR-155可靶向下調(diào)SOCS1蛋白，促使炎癥發(fā)展，如果上調(diào)miR-155表達(dá)，可增強(qiáng)SOCS1表達(dá)，抑制炎性反應(yīng)[20-21]。本文研究結(jié)果顯示，以白花丹提取物處理腎小球系膜細(xì)胞后，細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6及TGF-β1水平降低，細(xì)胞MDA水平、FN及Col IV蛋白表達(dá)降低，細(xì)胞SOD水平升高，且各項(xiàng)變化均對(duì)白花丹提取物呈劑量依賴性，表明白花丹提取物可抑制腎小球系膜細(xì)胞炎性反應(yīng)、致纖維化因子釋放、細(xì)胞外基質(zhì)合成及沉積，減輕氧化應(yīng)激損傷，揭示白花丹提取物可抑制腎小球系膜細(xì)胞分泌炎癥因子及細(xì)胞外基質(zhì)。此外，本研究還顯示，高糖可引起腎小球系膜細(xì)胞miR-155表達(dá)明顯升高，細(xì)胞SOCS1 mRNA及蛋白表達(dá)明顯降低，經(jīng)白花丹提取物處理后，腎小球系膜細(xì)胞miR-155表達(dá)降低，細(xì)胞SOCS1 mRNA及蛋白表達(dá)升高，表明在高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞分泌炎癥因子及細(xì)胞外基質(zhì)過程中，miR-155表達(dá)上調(diào)，SOCS1表達(dá)下調(diào)，而白花丹提取物可逆轉(zhuǎn)該過程，使miR-155表達(dá)下調(diào)，SOCS1表達(dá)上調(diào)，揭示下調(diào)miR-155表達(dá)、上調(diào)SOCS1表達(dá)可能是白花丹提取物抑制高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞分泌炎癥因子及細(xì)胞外基質(zhì)的作用機(jī)制。

綜上所述，白花丹提取物可抑制高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞致纖維化因子釋放、炎性反應(yīng)、細(xì)胞外基質(zhì)的合成及沉積，減輕氧化應(yīng)激損傷，最終抑制腎小球系膜細(xì)胞分泌炎癥因子及細(xì)胞外基質(zhì)，為臨床治療DN提供了新的思路。下調(diào)miR-155表達(dá)、上調(diào)SOCS1表達(dá)可能是白花丹提取物干預(yù)此過程的作用機(jī)制，但本研究未使用miR-155/SOCS1通路抑制劑和激動(dòng)劑進(jìn)行對(duì)照驗(yàn)證，存在不足，還需后續(xù)進(jìn)一步研究。