盧作奎 許為佳 史秀巖

442000 十堰，湖北省十堰市太和醫(yī)院腎內(nèi)科

慢性腎小球腎炎(chronic glomerulonephritis，CGN)是慢性腎臟病(CKD)的主要組成部分，也是終末期腎病最常見的病因。近年來，CGN發(fā)病率和死亡率呈不斷上升的趨勢；CGN的發(fā)生不僅給病人帶來了極大的痛苦，同時(shí)也帶來了巨大的社會(huì)負(fù)擔(dān)。CGN的特點(diǎn)是慢性炎癥、免疫異常、血管重塑、氧化應(yīng)激、腎功能喪失、腎小球和腎小管間質(zhì)瘢痕口等[1-2]。其發(fā)病的確切機(jī)制尚不清楚，有少數(shù)CGN是由急性腎炎發(fā)展所致，約占15～20%。大多數(shù)CGN由各種腎小球疾病發(fā)展而來，表現(xiàn)為慢性起病。

DMBT1是一種分子量為340 kDa的糖蛋白，包含14個(gè)半胱氨酸受體結(jié)構(gòu)域重復(fù)序列(scavenger receptor cysteine-rich，SRCR)，2個(gè)C1r/C1s-Uegf-BMp1結(jié)構(gòu)域和一個(gè)羧基末端透明帶結(jié)構(gòu)域[3-4]。DMBT1由已知的介導(dǎo)蛋白-蛋白相互作用的氨基酸序列組成，其功能是作為革蘭氏陽性和陰性細(xì)菌的模式識(shí)別分子。有報(bào)道指出，DMBT1基因表達(dá)下調(diào)參與多種髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展[5]。另有報(bào)道顯示DMBT1在正常胃粘膜和胃腫瘤中的異常表達(dá)，作為腫瘤相關(guān)性基因參與腫瘤調(diào)控[6]。最近的研究表明：DMBT1參與炎癥和組織纖維化過程中免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)，與慢性炎癥、組織纖維化異常等相關(guān)[7]。但目前尚無DMBT1在CGN中的作用研究。因此，本文通過研究DMBT1在CGN組織的相對(duì)表達(dá)和甲基化，及DMBT1對(duì)人腎小球足細(xì)胞(human glomerular podocyte，HPC)遷移的影響，以揭示其在CGN中的作用，為CGN的治療尋找相應(yīng)的靶點(diǎn)。

資料與方法

一、實(shí)驗(yàn)試劑與研究對(duì)象

1.主要試劑 HPC細(xì)胞購于上海生科所細(xì)胞庫。胰蛋白酶、胎牛血清和1640培養(yǎng)液等購買于美國CST公司；本課題中引物由深圳華大基因設(shè)計(jì)并合成，本研究中引物見表1。DNA提取試劑盒套裝購買于美國Invitrogen公司，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光半定量PCR購買于上海碧云天實(shí)驗(yàn)公司；組織蛋白提取試劑盒購買于美國賽默飛生物科技公司。本課題中大型儀器和設(shè)備主要包括恒溫細(xì)胞孵育箱、生物細(xì)胞安全柜、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀和蛋白電泳凝膠成像儀等，由太和醫(yī)院公共實(shí)驗(yàn)平臺(tái)提供。

2.研究對(duì)象 選取十堰市太和醫(yī)院2015年1月至2018年12月收治的86例CGN患者。CGN的診斷參考2003年國際腎臟病學(xué)會(huì)和腎臟病理學(xué)會(huì)聯(lián)合制定的國際標(biāo)準(zhǔn)及已有的文獻(xiàn)報(bào)告[8]。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)存在3個(gè)月及以上的腎臟功能或結(jié)構(gòu)異常；(2)存在腎臟病理學(xué)檢查異常和/或腎臟損傷；(3)存在3個(gè)月及以上的腎小球?yàn)V過率低于60 mL·min-1·(1.73 m2)-1，有或無腎結(jié)構(gòu)、功能損傷[8]。86例CGN患者中，男性患者54例，女性患者32例，年齡11～49歲，中位年齡24.4歲；病程：4個(gè)月～6年，平均病程(1.16±0.23)年。納入患者的主要病理分型包括：系膜增生性腎小球腎炎、系膜毛細(xì)血管性腎小球腎炎、膜性腎病、局灶節(jié)段性腎小球硬化等。另外選取我院30例行腎癌手術(shù)切除的癌旁正常腎組織(距離腫瘤組織約5 cm)患者作為正常腎臟對(duì)照組，其中男性8例，女性12例，平均年齡(62.8±5.6)歲。

二、方法

1.DNA和RNA提取 使用DNA zol套裝和QIAamp DNA套裝提取腎組織中DNA，提取方法參考試劑盒中的說明書和已有的文獻(xiàn)報(bào)道[9]。RNA提取方法主要包括：(1)勻漿處理(組織勻漿或細(xì)胞消化離心)；(2)將勻漿樣品在室溫(15～30 ℃)放置5 min，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離；(3)加入0.2 mL氯仿，劇烈振蕩15 s，室溫放置3 min，得到水相液；(4)異丙醇沉淀水相中的RNA；(5)離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀，75%乙醇洗滌RNA沉淀，RNA沉淀干燥后加入無RNase水溶解。提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，實(shí)驗(yàn)方法參考試劑盒中的說明書和已有的文獻(xiàn)報(bào)道[9]。處理好的cDNA和DNA保存于-80 ℃冰箱保存。

2.甲基化PCR檢測 亞硫酸氫鹽修飾DNA和甲基化特異性PCR(MSP)方法同已有的文獻(xiàn)報(bào)道[10]。MSP分析顯示，MSP引物在未亞硫酸化的DNA中沒有擴(kuò)增產(chǎn)物，因此具有特異性。MSP在2%含100 bp DNA標(biāo)記的瓊脂糖凝膠上實(shí)驗(yàn)；加入AmpliTaq-Gold DNA Polymerase酶，退火溫度為60 ℃或55 ℃，反應(yīng)周期：40 cycles。甲基化和非甲基化人類DNA分別用作陽性和陰性對(duì)照。甲基化特異性引物見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)相關(guān)引物

3.半定量PCR檢測 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real time quantitative PCR，qRT-PCR)的實(shí)驗(yàn)方法和統(tǒng)計(jì)方法同參考文獻(xiàn)[11]，通過qRT-PCR檢測DMBT1 mRNA在正常腎上皮組織、CGN患者腎組織中的相對(duì)表達(dá)；及DMBT1對(duì)WNT信號(hào)通路相關(guān)因子的影響。qRT-PCR上機(jī)總反應(yīng)體系如下：95 °C 5 min；95 °C 30 s；55 °C 30 s；72 °C 30 s；25 °C 10 min。其中內(nèi)參循環(huán)23 cycle，目的循環(huán)32 cycle。所有實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)三次。

4.細(xì)胞轉(zhuǎn)染 HPC細(xì)胞的培養(yǎng)和方法同已有的文獻(xiàn)報(bào)道[12]。將活性狀態(tài)下HPC種植于六孔板，當(dāng)細(xì)胞密度生長至80%～90%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染；用脂質(zhì)體Lipofectamine-2000(invitrogen)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分別轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒NEG和目前質(zhì)粒DMBT1(購買于廣州復(fù)能基因)。轉(zhuǎn)染后加入細(xì)胞孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，加入G418進(jìn)行細(xì)胞篩選二周獲得穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系，進(jìn)行后續(xù)功能實(shí)驗(yàn)。

5.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)用于檢測DMBT1對(duì)細(xì)胞遷移的影響。將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的DMBT1轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組細(xì)胞平鋪種植于六孔板中(5×105細(xì)胞/孔)，加入細(xì)胞孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度至90%時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞層用無菌的P-20移液管尖刮傷，然后用PBS沖洗兩次，小心去除細(xì)胞碎片，并在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。每12小時(shí)于100倍顯微鏡下拍照，觀察細(xì)胞的相對(duì)遷移率。所有實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)三次。

6.免疫蛋白印跡實(shí)驗(yàn) 免疫蛋白印跡(western blot)實(shí)驗(yàn)方法的步驟和統(tǒng)計(jì)方法同參考文獻(xiàn)[13]，當(dāng)DMBT1質(zhì)粒或空載體對(duì)照進(jìn)行轉(zhuǎn)染48 h后，從轉(zhuǎn)染細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)。然后用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離細(xì)胞裂解液，然后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜。在PBST中用5%的牛奶封閉1 h后，用DMBT1、β-catenin、active-β-catenin、c-Myc、Cyclin D1、E-canherin、N-cadherin、Vimentin及SALL1等相關(guān)一抗(abcam)4 ℃孵育過夜。第二天常溫下復(fù)溫0.5 h后，PBST液洗膜3次，每次10 min；加入二抗封閉液室溫下孵育1～2 h，使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)顯示免疫印跡；GAPDH用作對(duì)照。所有實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)三次。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、DMBT1 mRNA和蛋白在CGN組織中表達(dá)情況

采用免疫蛋白印跡實(shí)驗(yàn)分析DMBT1蛋白在CGN、正常腎上皮組織中相對(duì)表達(dá)；結(jié)果顯示：與正常腎上皮組織相比，DMBT1蛋白在CGN組織中表達(dá)下調(diào)(P<0.01)(圖1A)；進(jìn)一步分析DMBT1蛋白的表達(dá)與CGN中臨床病理特征的相關(guān)性，結(jié)果顯示DMBT1蛋白表達(dá)下調(diào)程度與CGN病理類型(P=0.214)、腎功能(P=0.451)及腎纖維化程度(P=0.562)無明顯相關(guān)性。同時(shí)qRT-PCR試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與正常腎上皮細(xì)胞相比，DMBT1 mRNA在CGN組織表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖1B)。通過免疫組化染色發(fā)現(xiàn)DMBT1定位于腎小球細(xì)胞胞質(zhì)中(圖1C)，與以往文獻(xiàn)結(jié)果相一致[5-6]。以上結(jié)果提示DMBT1的表達(dá)下調(diào)可能作為CGN相關(guān)基因參與腎病的發(fā)生發(fā)展。

注：CGN為慢性腎小球腎炎，Normal為正常腎上皮組織圖1 DMBT1蛋白及mRNA在不同腎組織中的表達(dá)情況 A.DMBT1蛋白在不同腎組織中的表達(dá)情況，B.DMBT1 mRNA在不同腎組織中的表達(dá)情況，C.DMBT1在腎組織中的定位情況

二、DMBT1在CGN組織中甲基化表達(dá)情況

啟動(dòng)子異常甲基化是導(dǎo)致多種抑癌基因表達(dá)沉默的重要機(jī)制，文獻(xiàn)顯示DMBT1啟動(dòng)子含有多個(gè)甲基島(CpG島)序列[14]，提示DMBT1可能作為重要的甲基化基因參與腫瘤的進(jìn)程。本研究中甲基化PCR結(jié)果顯示：在絕大多數(shù)CGN患者中均發(fā)生DMBT1啟動(dòng)子甲基化(甲基化率為83.7%)，但在正常腎組織中卻沒有甲基化(圖2)。因此，我們推測DMBT1基因甲基化可能參與CGN的進(jìn)程。

注：M為甲基化，U為非甲基化，ddH2O為陰性對(duì)照?qǐng)D2 DMBT1在不同腎組織中甲基化表達(dá)情況

三、DMBT1對(duì)人腎小球足細(xì)胞遷移的影響

為進(jìn)一步探討DMBT1對(duì)HPC細(xì)胞遷移的影響，我們進(jìn)行了細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，DMBT1轉(zhuǎn)染的HPC細(xì)胞在48 h后傷口的愈合能力明顯延遲，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖3A、3B)。體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)顯示，過表達(dá)DMBT1后，腎小球足細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變(圖3C)。因此我們推測DMBT1可能作為腎病相關(guān)的功能性基因參與CGN的進(jìn)程。

圖3 DMBT1對(duì)腎小球足細(xì)胞遷移的影響 A.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，B.DMBT1轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組細(xì)胞遷移率比較折線圖，C.體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

四、DMBT1對(duì)WNT/β-catenin信號(hào)通路的作用

分別取DMBT1轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組細(xì)胞，提取總蛋白，采用免疫蛋白印跡法檢測WNT/β-catenin以及下游靶基因、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)分子的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，DMBT1轉(zhuǎn)染后active-β-catenin、C-myc、Vimentin、N-cadherin和Snail1的蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.01)；E-cadherin的蛋白表達(dá)水平上調(diào)(P<0.01)。(圖4)

注：與對(duì)照組比較，aP<0.01圖4 DMBT1對(duì)WNT/β-catenin信號(hào)通路的作用 A.免疫蛋白印跡實(shí)驗(yàn)，B.DMBT1轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組細(xì)胞active-β-catenin、C-myc、Vimentin、N-cadherin、E-cadherin、Snail1的蛋白表達(dá)水平比較

討 論

DNA甲基化是一種常見的表觀遺傳學(xué)機(jī)制，通過甲基化修飾使基因表達(dá)沉默[11]；DNA甲基化主要發(fā)生在CpG位點(diǎn)的胞嘧啶殘基上，DNA甲基化是維持組織/細(xì)胞中基因表達(dá)狀態(tài)特異性的重要機(jī)制[11]。在病理學(xué)的機(jī)制中，異常的DNA甲基化和隨之出現(xiàn)基因異常表達(dá)可能與許多疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，包括癌癥、心血管疾病、代謝紊亂(肥胖和糖尿病)和腎臟疾病[15]。在過去的幾年中，對(duì)CKD患者進(jìn)行的研究表明：全身DNA甲基化模式與腎功能下降相關(guān)[16]。最近一項(xiàng)關(guān)于社區(qū)動(dòng)脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn)和心臟疾病患者全血DNA甲基化的表觀全基因組關(guān)聯(lián)研究顯示，特定CpG位點(diǎn)(如JAZF1中的CG23597162、PTPN6/PHB2中的CG19942083、ZNF788/ZNF20中的CG17944885)的DNA甲基化水平與腎小球?yàn)V過率降低、發(fā)生CKD或腎功能損害之間存在關(guān)聯(lián)[17-18]。

上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transformation，EMT)是指上皮細(xì)胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過程。在胚胎發(fā)育、慢性炎癥、組織重建、癌癥轉(zhuǎn)移和多種纖維化疾病中發(fā)揮了重要作用，其主要的特征有細(xì)胞黏附分子(如E-鈣黏蛋白)表達(dá)的減少、細(xì)胞角蛋白轉(zhuǎn)化為波形蛋白為主的細(xì)胞骨架及形態(tài)上具有間充質(zhì)細(xì)胞的特征等。通過EMT，上皮細(xì)胞失去了細(xì)胞極性，失去與基底膜的連接等上皮表型，獲得了較高的遷移與侵襲、抗凋亡和降解細(xì)胞外基質(zhì)的能力等間質(zhì)表型。EMT是腎臟纖維化的重要環(huán)節(jié)，而間質(zhì)纖維化是所有CKD終末期的表現(xiàn)，并最終導(dǎo)致腎功能衰竭[19]。WNT/β-catenin信號(hào)通過誘導(dǎo)其靶基因可影響不同生物學(xué)行為，與調(diào)節(jié)器官發(fā)育和腫瘤發(fā)生密切相關(guān)；WNT/β-catenin在腎損傷和纖維化中有部分特異性的靶點(diǎn)，如Snail1等。Snail1是一個(gè)關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，可影響EMT進(jìn)程[20]；Snail1轉(zhuǎn)錄抑制上皮性鈣黏附蛋白的表達(dá)，并導(dǎo)致上皮細(xì)胞-細(xì)胞黏附的破壞，Snail1和β-catenin活化蛋白均上調(diào)，β-catenin的激活在體外誘導(dǎo)了腎小管上皮細(xì)胞和腎小球足細(xì)胞中的Snail1表達(dá)，在纖維化疾病中占主導(dǎo)地位。因此，研究CGN患者DNA甲基化及EMT相關(guān)調(diào)節(jié)基因?qū)沂綜GN的發(fā)生發(fā)展具有重要的臨床意義。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，DMBT1 mRNA和蛋白在CGN患者中表達(dá)明顯下調(diào)，DMBT1蛋白表達(dá)下調(diào)程度與CGN病理類型、腎功能及腎纖維化程度無明顯相關(guān)性；甲基化PCR分析進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，與正常腎組織相比，DMBT1在CGN腎組織中甲基化程度明顯升高；提示DMBT1可能作為重要甲基化基因影響CGN的進(jìn)程。腎小管間質(zhì)纖維化是影響CGN發(fā)展和預(yù)后的重要因素，腎小管EMT是腎小管間質(zhì)纖維化的重要機(jī)制。當(dāng)EMT發(fā)生時(shí)，腎小管上皮細(xì)胞失去了上皮細(xì)胞的特性，并促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展[21-22]。而本研究通過細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，DMBT1的表達(dá)能影響細(xì)胞遷移，提示DMBT1基因甲基化丟失可能與CGN的間質(zhì)纖維化密切相關(guān)。另有文獻(xiàn)顯示，WNT/β-catenin信號(hào)通路及下游的分子靶點(diǎn)與CKD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[19-20]。而本研究發(fā)現(xiàn)，在腎小球足細(xì)胞HPC中，過表達(dá)DMBT1基因后，active-β-catenin、c-Myc、cyclinD1、Vimentin、N-cadherin和Snail1的蛋白表達(dá)水平降低，E-cadherin的蛋白表達(dá)水平升高；因此，我們推測DMBT1可能通過調(diào)控WNT/β-catenin信號(hào)通路，抑制上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)變，從而影響CGN的進(jìn)程。

本研究證實(shí)了DMBT1在CGN中的表達(dá)及調(diào)控，有助于我們進(jìn)一步的了解CGN的發(fā)病及發(fā)展的機(jī)制，同時(shí)使我們了解了腎小球腎炎從蛋白尿到纖維化的分子調(diào)控機(jī)制，為CGN的治療提供了新的思路。