袁 琳， 代亞坤， 高炳淼

(海南醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院/熱帶轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/海南省熱帶藥用植物研究開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 海南 ?？?571199)

?？?Sea anemone)又名海菊花，屬腔腸動(dòng)物門珊瑚蟲(chóng)綱六放珊瑚亞綱?？縖1]，是原始海洋生物?，F(xiàn)代藥理研究表明，海葵毒素具有免疫調(diào)節(jié)、抗菌、降血壓[2]、強(qiáng)心[3]、抗寄生蟲(chóng)[4]和抗腫瘤[5]等藥理活性。?？Y源的研究前景廣闊，不僅可食用、藥用，還可向化工、飼料、農(nóng)藥、化妝品等方向轉(zhuǎn)化和應(yīng)用[6]。獲得純度高、完整性好的高質(zhì)量RNA是南海?？M(jìn)行分子生物學(xué)研究的重要前提[7]，對(duì)c DNA文庫(kù)構(gòu)建和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等的深入研究具有重要意義，提高RNA純度及經(jīng)濟(jì)快捷獲得足量的RNA是當(dāng)前受到關(guān)注的問(wèn)題。

目前，傳統(tǒng)提取RNA的方法有熱酚法[8]、Trizol法[9]、異硫氰酸胍法[10]、氯化胍法[11]、CTAB法、SDS法等，但沒(méi)有一種RNA提取方法適用于所有的生物。對(duì)?？难芯恐饕性诤？舅氐奶崛》蛛x、化學(xué)合成、藥理活性等方面，國(guó)內(nèi)少見(jiàn)關(guān)于?？鸕NA提取分離方面的報(bào)道。因此，以南海海葵為研究對(duì)象，采用改進(jìn)TRIzol法[12]提取海葵不同發(fā)育時(shí)期的總RNA，經(jīng)瓊脂糖電泳和Agilent 2100生物分析儀檢測(cè) RNA的完整性和純度，獲得?？兌雀?、完整性好的高質(zhì)量RNA,以期為海葵高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等分子生物學(xué)的深入研究提供基礎(chǔ)，也為其他海洋生物RNA的提取提供參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品材料不同發(fā)育期的海葵，采自南海海域，經(jīng)鑒定為套膜?？?Aiptasiapallida)，選擇早中晚3個(gè)發(fā)育時(shí)期的海葵各1只，樣品名稱分別為?？?小、?？?中和海葵-大。海葵樣品經(jīng)去離子水沖洗干凈，于-80℃冰箱冷凍儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2試劑DEPC和TRIzol試劑盒(賽百盛公司)，RNA locker和RNA down(天澤基因工程有限公司)，RNase Inhibitor(TaKaRa公司)，其他試劑均為分析純。

1.1.3儀器Agilent 2100生物分析儀(美國(guó)安捷倫公司)，Nano Drop TM 2000分光光度計(jì)(Thermo Fisher，USA)，電泳儀(凝膠成像儀為美國(guó)伯樂(lè)公司)。

1.2方法

1.2.1?？俁NA的提取采用改進(jìn)TRIzol一步法提取不同發(fā)育期海葵的總RNA[12]。具體步驟：將?？湃肜涞?00 μL RNA locker中，靜置1 min后勻漿；將勻漿液充分震蕩，室溫靜置10 min；加入300 μL氯仿，充分震蕩，室溫靜置后離心；異丙醇沉淀 RNA時(shí)，加入5 μL的RNA down，再加入500 μL的異丙醇，振蕩后于20℃靜置 30～60 min后離心；75%乙醇洗滌，室溫干燥RNA沉淀；加入適量DEPC處理水(含RNase Inhibitor，終濃度為0.2 U/μL)，4℃下溶解2～6 h后于-70℃保存。

1.2.2總RNA的初步檢測(cè)分別取?？?小、?？?中、?？?大RNA樣品與溴酚藍(lán)上樣緩沖液混合，加入含Goldview的1.0%瓊脂糖凝膠，180V電泳16 min，然后用凝膠成像儀拍照保存。

1.2.3總 RNA的質(zhì)量檢測(cè)將RNA樣品在冰上融化，混勻后4℃離心。分別取RNA提取液各1 μL，稀釋100倍后，Nano Drop TM 2000分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的純度(OD260/280)和濃度[13]。Agilent 2100生物分析儀對(duì)RNA完整性的質(zhì)量評(píng)估參數(shù)，能準(zhǔn)確而直觀地評(píng)估RNA樣品的質(zhì)量[13]，并篩選出高質(zhì)量樣本，因此，采用Agilent 2100生物分析儀自動(dòng)檢測(cè)不同發(fā)育時(shí)期海葵的總RNA的完整性(RIN值)。質(zhì)檢等級(jí)分為A、B、C 3個(gè)等級(jí)， A級(jí)指質(zhì)量滿足建庫(kù)測(cè)序要求，且總量可滿足2次或2次以上建庫(kù)需要的樣品；B級(jí)指質(zhì)量滿足建庫(kù)測(cè)序要求，且總量滿足1次但不足2次建庫(kù)需要的樣品；C級(jí)指質(zhì)量/總量不完全滿足建庫(kù)測(cè)序要求，可以風(fēng)險(xiǎn)建庫(kù)，但不保證測(cè)序樣品的質(zhì)量。28S/18S為衡量提取的RNA降解情況及完整性的指標(biāo)，28S/18S在1.8～2.0則表明所提取RNA基本無(wú)降解發(fā)生，且完整性較好。

2結(jié)果與分析

2.1改進(jìn)TRIzol法提取?？俁NA的效果

由圖 1可知，3個(gè)發(fā)育時(shí)期的?？俁NA的28S和18S條帶清晰，5S條帶模糊。28S條帶較18S條帶更明亮。28S條帶與點(diǎn)樣孔間無(wú)明顯亮帶，說(shuō)明無(wú)DNA污染條帶[14]。初步檢測(cè)說(shuō)明，采用改進(jìn)TRIzol法提取?？俁NA的瓊脂糖電泳結(jié)果較好，改進(jìn)TRIzol法能有效提取?？煌l(fā)育時(shí)期的總RNA。

注：M為低分子量蛋白Marker；1、2和3分別表示?？?大、?？?中和?？?小的總RNA條帶。

Note: M, Marker; 1, 2 and 3 indicate total RNA bands in large, medium and small sea anemones respectively.

圖1 改進(jìn)TRIzol法提取?？俁NA的效果

Fig.1 Total RNA extraction from sea anemone by improved TRIzol method

2.2?？俁NA的質(zhì)量

從表1可看出改進(jìn)TRIzol法提取不同發(fā)育時(shí)期?？俁NA的質(zhì)量。

2.2.1濃度改進(jìn)TRIzol法提取不同發(fā)育時(shí)期海葵總RNA的濃度以?？?中最大，為357 ng/μL；?？?大其次，為335 ng/μL；?？?小最低，為232 ng/μL。

2.2.2 純度?？?小、?？?中和?？?大總RNA的OD260/280值分別為2.071、1.983和1.981，依據(jù)純RNA的標(biāo)準(zhǔn)(1.9

2.2.3完整性?？?小的RIN值較小，為6.4；28S/18S為1，與1.8～2.0相差較大；質(zhì)檢等級(jí)為C。說(shuō)明?？?小的完整性不合格，純度較低，有輕微雜質(zhì)污染，其質(zhì)量或總量不完全滿足建庫(kù)測(cè)序要求，可以風(fēng)險(xiǎn)建庫(kù)，但不能保證測(cè)序樣品的質(zhì)量。?？?中與?？?大的RIN值分別為7.3和8.8，均大于7；28S/18S分別為2.4和1.9，均大于1.8；質(zhì)檢等級(jí)均為A。說(shuō)明，?？?中和?？?大的總RNA完整性較高，總RNA的質(zhì)量滿足建庫(kù)測(cè)序要求，且總量可滿足2次或2次以上建庫(kù)需要的樣品，可用于進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

表1 改進(jìn)TRIzol法提取不同發(fā)育時(shí)期?？俁NA的質(zhì)量

3結(jié)論與討論

隨著分子生物技術(shù)在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等方面的廣泛應(yīng)用，RNA提取已成為研究基因表達(dá)、克隆目的基因等的一項(xiàng)基本試驗(yàn)技術(shù)。高質(zhì)量RNA的提取，是后續(xù)RT-PCR、Northern blot、c DNA文庫(kù)構(gòu)建等正常進(jìn)行的必要前提[15]。動(dòng)物組織RNA的提取技術(shù)已非常成熟，已有大量研究者利用各種方法和商業(yè)化試劑成功提取高質(zhì)量的RNA[16-17]。由于RNA非常不穩(wěn)定，易降解，且RNA酶的存在使得提取完整性好、質(zhì)量高的RNA變得尤其重要[18]。因此，有效抑制RNA酶活性及去除蛋白質(zhì)和DNA的污染是獲得高質(zhì)量RNA的關(guān)鍵[19]。熱酚、TRIzol等傳統(tǒng)提取RNA的方法可很好地提取微生物和動(dòng)物組織的RNA[20]，其中，TRIzol法是用于提取少量組織總RNA的經(jīng)典方法，但傳統(tǒng)TRIzol法提取總RNA效果較差，RNA易降解，改進(jìn)TRIzol法能有效提高RNA產(chǎn)率，減少RNA降解，延長(zhǎng)RNA儲(chǔ)存時(shí)間[12]。

采用改進(jìn)TRIzol法提取不同發(fā)育時(shí)期?？目俁NA，并對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，中晚期?？俁NA的OD260/280值約為2.0，純度較高，是高質(zhì)量RNA的標(biāo)志[17]。采用改進(jìn)TRIzol法所提取的?？鸕NA條帶整齊、清晰，?？?大與海葵-中的總RNA完整性較好，RIN值分別為8.8和7.3，?？?大與海葵-中的帶型呈現(xiàn)28S∶18S約為2∶1，說(shuō)明RNA基本無(wú)降解，且完整性好[21]。采用Nano Drop TM 2000分光光度計(jì)對(duì)總RNA純度(OD260/280)的檢測(cè)、Agilent 2100生物分析儀質(zhì)量檢測(cè)與電泳檢測(cè)均強(qiáng)有力地支持以上結(jié)果。

綜上，采用改進(jìn)TRIzol法提取不同發(fā)育期?？俁NA的濃度高、純度和完整性較好，改進(jìn)TRIzol法能有效提取?？煌l(fā)育時(shí)期的總RNA，滿足轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等分子生物學(xué)試驗(yàn)要求，可為?？M(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等分子生物學(xué)試驗(yàn)提供基礎(chǔ)，同時(shí)也可為海洋動(dòng)物RNA的提取提供參考。