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        改進(jìn)TRIzol法提取不同發(fā)育時(shí)期海葵的總RNA

        2020-06-03 02:51:38代亞坤高炳淼
        貴州農(nóng)業(yè)科學(xué) 2020年4期
        關(guān)鍵詞:高質(zhì)量質(zhì)量

        袁 琳, 代亞坤, 高炳淼

        (海南醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院/熱帶轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/海南省熱帶藥用植物研究開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 海南 ???571199)

        ???Sea anemone)又名海菊花,屬腔腸動(dòng)物門珊瑚蟲(chóng)綱六放珊瑚亞綱??縖1],是原始海洋生物?,F(xiàn)代藥理研究表明,海葵毒素具有免疫調(diào)節(jié)、抗菌、降血壓[2]、強(qiáng)心[3]、抗寄生蟲(chóng)[4]和抗腫瘤[5]等藥理活性。??Y源的研究前景廣闊,不僅可食用、藥用,還可向化工、飼料、農(nóng)藥、化妝品等方向轉(zhuǎn)化和應(yīng)用[6]。獲得純度高、完整性好的高質(zhì)量RNA是南海??M(jìn)行分子生物學(xué)研究的重要前提[7],對(duì)c DNA文庫(kù)構(gòu)建和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等的深入研究具有重要意義,提高RNA純度及經(jīng)濟(jì)快捷獲得足量的RNA是當(dāng)前受到關(guān)注的問(wèn)題。

        目前,傳統(tǒng)提取RNA的方法有熱酚法[8]、Trizol法[9]、異硫氰酸胍法[10]、氯化胍法[11]、CTAB法、SDS法等,但沒(méi)有一種RNA提取方法適用于所有的生物。對(duì)??难芯恐饕性诤?舅氐奶崛》蛛x、化學(xué)合成、藥理活性等方面,國(guó)內(nèi)少見(jiàn)關(guān)于??鸕NA提取分離方面的報(bào)道。因此,以南海海葵為研究對(duì)象,采用改進(jìn)TRIzol法[12]提取海葵不同發(fā)育時(shí)期的總RNA,經(jīng)瓊脂糖電泳和Agilent 2100生物分析儀檢測(cè) RNA的完整性和純度,獲得??兌雀?、完整性好的高質(zhì)量RNA,以期為海葵高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等分子生物學(xué)的深入研究提供基礎(chǔ),也為其他海洋生物RNA的提取提供參考。

        1材料與方法

        1.1材料

        1.1.1樣品材料不同發(fā)育期的海葵,采自南海海域,經(jīng)鑒定為套膜???Aiptasiapallida),選擇早中晚3個(gè)發(fā)育時(shí)期的海葵各1只,樣品名稱分別為???小、???中和海葵-大。海葵樣品經(jīng)去離子水沖洗干凈,于-80℃冰箱冷凍儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

        1.1.2試劑DEPC和TRIzol試劑盒(賽百盛公司),RNA locker和RNA down(天澤基因工程有限公司),RNase Inhibitor(TaKaRa公司),其他試劑均為分析純。

        1.1.3儀器Agilent 2100生物分析儀(美國(guó)安捷倫公司),Nano Drop TM 2000分光光度計(jì)(Thermo Fisher,USA),電泳儀(凝膠成像儀為美國(guó)伯樂(lè)公司)。

        1.2方法

        1.2.1??俁NA的提取采用改進(jìn)TRIzol一步法提取不同發(fā)育期海葵的總RNA[12]。具體步驟:將??湃肜涞?00 μL RNA locker中,靜置1 min后勻漿;將勻漿液充分震蕩,室溫靜置10 min;加入300 μL氯仿,充分震蕩,室溫靜置后離心;異丙醇沉淀 RNA時(shí),加入5 μL的RNA down,再加入500 μL的異丙醇,振蕩后于20℃靜置 30~60 min后離心;75%乙醇洗滌,室溫干燥RNA沉淀;加入適量DEPC處理水(含RNase Inhibitor,終濃度為0.2 U/μL),4℃下溶解2~6 h后于-70℃保存。

        1.2.2總RNA的初步檢測(cè)分別取???小、???中、???大RNA樣品與溴酚藍(lán)上樣緩沖液混合,加入含Goldview的1.0%瓊脂糖凝膠,180V電泳16 min,然后用凝膠成像儀拍照保存。

        1.2.3總 RNA的質(zhì)量檢測(cè)將RNA樣品在冰上融化,混勻后4℃離心。分別取RNA提取液各1 μL,稀釋100倍后,Nano Drop TM 2000分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的純度(OD260/280)和濃度[13]。Agilent 2100生物分析儀對(duì)RNA完整性的質(zhì)量評(píng)估參數(shù),能準(zhǔn)確而直觀地評(píng)估RNA樣品的質(zhì)量[13],并篩選出高質(zhì)量樣本,因此,采用Agilent 2100生物分析儀自動(dòng)檢測(cè)不同發(fā)育時(shí)期海葵的總RNA的完整性(RIN值)。質(zhì)檢等級(jí)分為A、B、C 3個(gè)等級(jí), A級(jí)指質(zhì)量滿足建庫(kù)測(cè)序要求,且總量可滿足2次或2次以上建庫(kù)需要的樣品;B級(jí)指質(zhì)量滿足建庫(kù)測(cè)序要求,且總量滿足1次但不足2次建庫(kù)需要的樣品;C級(jí)指質(zhì)量/總量不完全滿足建庫(kù)測(cè)序要求,可以風(fēng)險(xiǎn)建庫(kù),但不保證測(cè)序樣品的質(zhì)量。28S/18S為衡量提取的RNA降解情況及完整性的指標(biāo),28S/18S在1.8~2.0則表明所提取RNA基本無(wú)降解發(fā)生,且完整性較好。

        2結(jié)果與分析

        2.1改進(jìn)TRIzol法提取??俁NA的效果

        由圖 1可知,3個(gè)發(fā)育時(shí)期的??俁NA的28S和18S條帶清晰,5S條帶模糊。28S條帶較18S條帶更明亮。28S條帶與點(diǎn)樣孔間無(wú)明顯亮帶,說(shuō)明無(wú)DNA污染條帶[14]。初步檢測(cè)說(shuō)明,采用改進(jìn)TRIzol法提取??俁NA的瓊脂糖電泳結(jié)果較好,改進(jìn)TRIzol法能有效提取??煌l(fā)育時(shí)期的總RNA。

        注:M為低分子量蛋白Marker;1、2和3分別表示???大、???中和???小的總RNA條帶。

        Note: M, Marker; 1, 2 and 3 indicate total RNA bands in large, medium and small sea anemones respectively.

        圖1 改進(jìn)TRIzol法提取??俁NA的效果

        Fig.1 Total RNA extraction from sea anemone by improved TRIzol method

        2.2??俁NA的質(zhì)量

        從表1可看出改進(jìn)TRIzol法提取不同發(fā)育時(shí)期??俁NA的質(zhì)量。

        2.2.1濃度改進(jìn)TRIzol法提取不同發(fā)育時(shí)期海葵總RNA的濃度以???中最大,為357 ng/μL;???大其次,為335 ng/μL;???小最低,為232 ng/μL。

        2.2.2 純度???小、???中和???大總RNA的OD260/280值分別為2.071、1.983和1.981,依據(jù)純RNA的標(biāo)準(zhǔn)(1.9

        2.2.3完整性???小的RIN值較小,為6.4;28S/18S為1,與1.8~2.0相差較大;質(zhì)檢等級(jí)為C。說(shuō)明???小的完整性不合格,純度較低,有輕微雜質(zhì)污染,其質(zhì)量或總量不完全滿足建庫(kù)測(cè)序要求,可以風(fēng)險(xiǎn)建庫(kù),但不能保證測(cè)序樣品的質(zhì)量。???中與???大的RIN值分別為7.3和8.8,均大于7;28S/18S分別為2.4和1.9,均大于1.8;質(zhì)檢等級(jí)均為A。說(shuō)明,???中和???大的總RNA完整性較高,總RNA的質(zhì)量滿足建庫(kù)測(cè)序要求,且總量可滿足2次或2次以上建庫(kù)需要的樣品,可用于進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

        表1 改進(jìn)TRIzol法提取不同發(fā)育時(shí)期??俁NA的質(zhì)量

        3結(jié)論與討論

        隨著分子生物技術(shù)在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等方面的廣泛應(yīng)用,RNA提取已成為研究基因表達(dá)、克隆目的基因等的一項(xiàng)基本試驗(yàn)技術(shù)。高質(zhì)量RNA的提取,是后續(xù)RT-PCR、Northern blot、c DNA文庫(kù)構(gòu)建等正常進(jìn)行的必要前提[15]。動(dòng)物組織RNA的提取技術(shù)已非常成熟,已有大量研究者利用各種方法和商業(yè)化試劑成功提取高質(zhì)量的RNA[16-17]。由于RNA非常不穩(wěn)定,易降解,且RNA酶的存在使得提取完整性好、質(zhì)量高的RNA變得尤其重要[18]。因此,有效抑制RNA酶活性及去除蛋白質(zhì)和DNA的污染是獲得高質(zhì)量RNA的關(guān)鍵[19]。熱酚、TRIzol等傳統(tǒng)提取RNA的方法可很好地提取微生物和動(dòng)物組織的RNA[20],其中,TRIzol法是用于提取少量組織總RNA的經(jīng)典方法,但傳統(tǒng)TRIzol法提取總RNA效果較差,RNA易降解,改進(jìn)TRIzol法能有效提高RNA產(chǎn)率,減少RNA降解,延長(zhǎng)RNA儲(chǔ)存時(shí)間[12]。

        采用改進(jìn)TRIzol法提取不同發(fā)育時(shí)期??目俁NA,并對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明,中晚期??俁NA的OD260/280值約為2.0,純度較高,是高質(zhì)量RNA的標(biāo)志[17]。采用改進(jìn)TRIzol法所提取的??鸕NA條帶整齊、清晰,???大與海葵-中的總RNA完整性較好,RIN值分別為8.8和7.3,???大與海葵-中的帶型呈現(xiàn)28S∶18S約為2∶1,說(shuō)明RNA基本無(wú)降解,且完整性好[21]。采用Nano Drop TM 2000分光光度計(jì)對(duì)總RNA純度(OD260/280)的檢測(cè)、Agilent 2100生物分析儀質(zhì)量檢測(cè)與電泳檢測(cè)均強(qiáng)有力地支持以上結(jié)果。

        綜上,采用改進(jìn)TRIzol法提取不同發(fā)育期??俁NA的濃度高、純度和完整性較好,改進(jìn)TRIzol法能有效提取??煌l(fā)育時(shí)期的總RNA,滿足轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等分子生物學(xué)試驗(yàn)要求,可為??M(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等分子生物學(xué)試驗(yàn)提供基礎(chǔ),同時(shí)也可為海洋動(dòng)物RNA的提取提供參考。

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