龔偉偉， 趙懿琛，2*

(1.貴州大學(xué) 茶學(xué)院， 貴州 貴陽 550025； 2.山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/貴州省農(nóng)業(yè)生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽 550025)

杜仲(EucommiaulmoidesOliver)又名膠木，為杜仲科杜仲屬植物，是我國特有的一種名貴中藥材，通常以樹皮入藥[1]，具有降壓、調(diào)血脂、降血糖等藥理作用[2]。杜仲的藥用活性成分主要有環(huán)烯醚萜類、脂肪酸類、木脂素類和黃酮類等[3]。其中研究較多的為木脂素類[4]，目前已從杜仲中分離出木脂素類化合物27種，其中的松脂醇二葡萄糖苷是主要的降壓成分，其含有的糖苷結(jié)構(gòu)在調(diào)節(jié)血壓中發(fā)揮極其重要的作用[5]。糖基轉(zhuǎn)移酶(Glucosyltransferase，GT，EC 2．4．x．y)以UDP-Sugar為糖基供體，是植物中一大類催化糖苷取代反應(yīng)的酶，在植物體內(nèi)催化活化的糖連接到不同受體合成糖苷[6-7]，參與木質(zhì)素類、類黃酮、類固醇等產(chǎn)物的生物合成，對植物次生代謝、非生物脅迫以及調(diào)節(jié)激素活性等方面發(fā)揮著重要作用[8-9]。糖基化是在糖基轉(zhuǎn)移酶作用下，將糖轉(zhuǎn)移至蛋白質(zhì)形成糖苷鍵，對調(diào)節(jié)蛋白功能有重要作用[10]?；蛟吮磉_(dá)可用于研究目標(biāo)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能[11]。研究以貴州省農(nóng)業(yè)生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室前期克隆得到的杜仲糖基轉(zhuǎn)移酶編碼基因EuGT4為基礎(chǔ)，構(gòu)建EuGT4基因原核表達(dá)載體，并遺傳轉(zhuǎn)化大腸桿菌，從轉(zhuǎn)化菌株中鑒定出目標(biāo)基因表達(dá)的56 kD蛋白質(zhì)，旨在為進(jìn)一步研究杜仲糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)和功能提供基礎(chǔ)資料。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1杜仲EuGT4基因利用貴州省農(nóng)業(yè)生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的杜仲(EucommiaulmoidesOliver)基因組數(shù)據(jù)庫注釋信息，從杜仲克隆得到全長1 461 bp的糖基轉(zhuǎn)移酶cDNA序列(圖1)，預(yù)測其蛋白分子量為56 kD。

1.1.2試劑二硫蘇糖醇(DTT)、還原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)乙二胺四乙酸(EDTA)、尿素(Urea)、氯化鈉(NaCl)、甘油(Glycerol)、咪唑(咪唑)、IPTG、硫酸卡那霉素和TritionX-100購自生工生物工程(上海)股份有限公司(BBI)，Ni-IDA瓊脂糖凝膠、SDS-PAGE上樣緩沖液、SDS-PAGE電泳緩沖液、SDS-PAGE預(yù)制膠、ECL試劑盒、SDS-PAGE Marker、T4 DNA連接酶和WB Marker購自德泰生物科技(南京)有限公司， Taq DNA聚合酶購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.2方法

1.2.1原核表達(dá)載體的構(gòu)建將EuGT4基因插入含有限制性酶切位點(diǎn)NdeI和HindIII的pET30a表達(dá)載體，堿裂解法提取質(zhì)粒，NdeI/HindIII酶切后用瓊脂糖凝膠電泳檢測，并將構(gòu)建的質(zhì)粒送德泰生物科技(南京)有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果正確后，利用熱激法將pET30a-EuGT4轉(zhuǎn)入到大腸桿菌BL21(DE3)菌株中，在超凈臺內(nèi)用涂布棒均勻涂布于含50 μg/mL硫酸卡那霉素的LB平板上，37℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)過夜。載體結(jié)構(gòu)見圖2。

1.2.2EuGT4重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)從含50 μg/mL的硫酸卡那霉素的LB平板上挑取單個(gè)陽性克隆，在無菌操作下將其接種到含50 μg/mL的硫酸卡那霉素4Ml LB培養(yǎng)基中。紫外分光光度計(jì)測定菌液OD600為0.6左右時(shí)，向菌液里加入IPTG使其終濃度為0.2 mM，然后在15℃和37℃恒溫培養(yǎng)箱中分別誘導(dǎo)表達(dá)。

圖2 質(zhì)粒載體結(jié)構(gòu)

Fig.2 Plasmid vector structure

1.2.3EuGT4重組蛋白的表達(dá)形式鑒定誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液離心后除去上清液，沉淀在20 mM 咪唑含1% Triton X-100、1 mM PMSF、50 mM Tris(pH8.0)、1 mM DTT、50 mM Tris(pH8.0)以及300 mM NaCl混合溶液中重懸，然后在冰上于超聲破碎儀中超聲裂解。Ni-IDA親和層析柱用含有20 mM 咪唑、300 mM NaCl以及50 mM Tris(pH8.0)的混合溶液進(jìn)行平衡，用濃度為50 mM、100 mM和300 mM的咪唑在Ni-IDA親和層析柱上洗脫目的蛋白，取洗脫組分20 μL進(jìn)行SDS-PAGE檢測。

1.2.4EuGT4重組蛋白的純化與復(fù)性用含有300 mM NaCl (1% Triton X-100)、2 mM EDTA、50 mM Tris(pH8.0)以及5mM DTT混合溶液洗滌包涵體，4℃、12 000 rpm離心5 min，然后用含有20 mM咪唑、300 mM NaCl、8 M 尿素以及50 mM Tris(pH8.0)的混合溶液溶解包涵體沉淀。最后用濃度50 mM、100 mM和300 mM的咪唑在Ni-IDA親和層析柱上洗脫目的蛋白，取洗脫組分20 μL進(jìn)行SDS-PAGE檢測。根據(jù)鄒情等[12]描述的方法，對純化后的EuGT4重組蛋白進(jìn)行透析復(fù)性分析。

1.2.5EuGT4重組蛋白的Western Blot鑒定根據(jù)羅顯麟等[13]描述的方法，對得到的EuGT4重組蛋白進(jìn)行Western Blot鑒定。

2結(jié)果與分析

2.1原核表達(dá)載體的構(gòu)建

對構(gòu)建的原核表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，在限制性內(nèi)切酶NdeI和HindIII處理后，可獲得一條約1 500 bp大小的酶切片段，該片段大小與目標(biāo)基因大小相符(圖3)。

注：1,質(zhì)粒DNA；2,NdeI/HindIII酶切；3,DNA Marker。

Note: 1, plasmid DNA ; 2, digested with NdeI/HindIII;3, DNA Marker.

圖3 pET30a-EuGT4酶切膠圖

Fig.3 pET30a-EuGT4 digestion gel map

2.2EuGT4重組蛋白的表達(dá)

分別在15℃和37℃2個(gè)不同誘導(dǎo)溫度下對含有目標(biāo)載體的菌體進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，在IPTG(0.2 mM)誘導(dǎo)16 h后，可在37℃誘導(dǎo)組中獲得一條相對分子質(zhì)量大小為50 kD的特異性的蛋白條帶，該特異性條帶大小與生物信息學(xué)預(yù)測的目標(biāo)蛋白的大小基本相符，初步判斷為表達(dá)的EuGT4的重組蛋白(圖4)。

注：M, SDS-PAGE蛋白Marker; 0,對照(不加IPTG)；1,15℃誘導(dǎo)16 h；2, 37℃誘導(dǎo)16 h.

Note: M, SDS-PAGE protein Marker；0, CK(no addition with IPTG);1, induced for 16 h at 15℃; 2, induced for 16 h at 37℃.

圖4 EuGT4蛋白在BL21(DE3)表達(dá)情況

Fig.4 Expression of EuGT4 protein in BL21 (DE3)

2.3EuGT4重組蛋白的純化與復(fù)性

通過前期誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)確定在0.2 mM的IPTG誘導(dǎo)下，37 ℃誘導(dǎo)16 h為最佳誘導(dǎo)條件。對目標(biāo)蛋白進(jìn)行大量表達(dá)。由于EuGT4重組蛋白主要以包涵體的形式在沉淀中存在，因此需對目標(biāo)蛋白進(jìn)行純化及復(fù)性。利用含 Ni 柱的蛋白親和層析對蛋白進(jìn)行純化，分別收集50 mM、100 mM和300 mM咪唑洗脫組分進(jìn)行SDS-PAGE檢測(圖5)，以期獲得高純度的EuGT4重組蛋白。

通過純化分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，300 mM的咪唑濃度下EuGT4重組蛋白的濃度最大,可獲得純度較高的可溶性的重組蛋白(圖6)。經(jīng)透析復(fù)性并去除高濃度尿素后，可恢復(fù)其蛋白空間構(gòu)象，得到具有生物活性的蛋白，可用于后續(xù)相應(yīng)抗體的制備。

注：M,蛋白Marker；1,全菌裂解的上清；2,上清純化后流出液；3,洗脫組分(50 mM 咪唑)；4,洗脫組分(100 mM 咪唑)；5～6,洗脫組分(300 mM 咪唑)。

Note: M, protein Marker; 1, supernatant lysed by whole bacteria; 2, supernatant after purification; 3,elution fraction (50 mM imidazole); 4, elution fraction (100 mM imidazole); 5-6, elution fraction (300 mM imidazole).

圖5 EuGT4蛋白純化分析

Fig.5 Purification analysis of EuGT4 protein

注：M,蛋白Marker；1,離心后的包涵體上清； 2,上清純化后流出液；3,洗脫組分(50 mM 咪唑)；4～6,洗脫組分(100 mM 咪唑)；7～8,洗脫組分(300 mM 咪唑)。

Note: M, protein Marker; 1, inclusion supernatant after centrifugation; 2, supernatant after purification; 3,elution fraction (50 mM imidazole);4-6, elution fraction(100 mM imidazole); 7-8, elution fraction (300 mM imidazole).

圖6 包涵體純化分析

Fig.6 Purification analysis of inclusion bodies

2.4EuGT4重組蛋白的鑒定

利用重組EuGT4蛋白所攜帶的His標(biāo)簽蛋白的對應(yīng)抗體對重組蛋白進(jìn)行Western Blot鑒定，在相對分子質(zhì)量約50 kD處獲得一條特異性目標(biāo)條帶，其大小與重組蛋白相符，表明已成功獲得His- EuGT4重組蛋白(圖7)。

注： 1: BSA (1.50 μg)； 2:EuGT4基因蛋白(1.20 μg)；M1: SDS-PAGE蛋白Marker；M2: Western Blot 蛋白Marker。

Note: 1, BSA (1.50 μg); 2, EuGT4 gene protein (1.20 μg); M1, SDS-PAGE protein Marker; M2, Western Blot protein Marker.

圖7 EuGT4重組蛋白Western Blot檢測

Fig.7 Western Blot detection of EuGT4 recombinant protein

3結(jié)論與討論

糖基轉(zhuǎn)移酶廣泛地存在于植物體內(nèi)，其表達(dá)量的提高對植物既有利又有弊。有研究表明，糖基轉(zhuǎn)移酶基因3GT在天山雪蓮中過表達(dá)后，測定轉(zhuǎn)基因愈傷組織和WT愈傷組織中的總黃酮含量，數(shù)據(jù)顯示前者明顯高于后者[14]。而糖基轉(zhuǎn)移酶UGT84B1基因在擬南芥中過表達(dá)，會破壞轉(zhuǎn)基因擬南芥中的IAA糖基化過程，從而使根失去向地性[15]。前人研究還發(fā)現(xiàn)，糖基轉(zhuǎn)移酶和非生物脅迫之間也存在一定關(guān)系，從擬南芥中克隆得到UGT79B2/79B3基因能將鼠李糖基轉(zhuǎn)移到花青素和3-O-葡萄糖分子上，提高植物的抗逆性[16]；糖基轉(zhuǎn)移酶UGT76E11基因的異位表達(dá)增加擬南芥類黃酮的積累，增強(qiáng)其抵抗非生物脅迫的能力[17]。

隨著科技的不斷提升，人們對原核表達(dá)系統(tǒng)的遺傳背景更加明晰，原核表達(dá)系統(tǒng)因其外源蛋白表達(dá)水平高且純度能達(dá)90%以上、成本低及周期短等優(yōu)勢而被大量應(yīng)用于外源基因表達(dá)[18]。鄒情等[12]構(gòu)建Dirigent基因原核表達(dá)載體成功使其在BL21 (DE3)中主要以包涵體的形式表達(dá)，對包涵體進(jìn)行復(fù)性純化后得到可溶性且純度較高的重組蛋白。冷陽等[19]對杜仲EuGT2基因進(jìn)行原核表達(dá)，杜仲EuGT2基因以部分可溶性蛋白、部分包涵體的表達(dá)形式在E.coli Rosetta (DE3)中得到成功表達(dá)；羅顯麟等[12]對花煙草NaD1基因的進(jìn)行原核表達(dá)，確定最優(yōu)表達(dá)條件并在上清中獲得可溶性的蛋白。

研究根據(jù)1個(gè)已克隆的杜仲糖基轉(zhuǎn)移酶編碼基因EuGT4，利用基因重組技術(shù)構(gòu)建原核表達(dá)載體pET30a-EuGT4，遺傳轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，在37℃條件下以終濃度為0.2 mMol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)16 h，通過Ni-IDA親和層析柱進(jìn)行純化，得到以包涵體的形式在BL21(DE3)中表達(dá)的EuGT4重組蛋白，分子量約為50 kD，研究結(jié)果為進(jìn)一步研究杜仲糖基轉(zhuǎn)移酶功能提供了科學(xué)依據(jù)。