駱治昊，田 芬，韋宇拓**

(1.廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530005；2.亞熱帶農(nóng)業(yè)資源保護利用與利用國家重點實驗室，廣西南寧 530005)

0 引言

近年來，我國水體重金屬污染現(xiàn)象越來越嚴(yán)重，我國七大水系——長江、黃河、淮河、松花江、遼河、海河和珠江水系沉積物中Cd、As、Zn、Pb、Cu、Hg和Cr等的污染現(xiàn)狀不容樂觀[1]。而這些污染的主要來源是礦石開采、廢水灌溉、污水排放、化工生產(chǎn)、電鍍行業(yè)，等等[2]。這些排放到環(huán)境的重金屬不但不能被生物降解，還會參與食物鏈循環(huán)在生物體內(nèi)富集，當(dāng)人體器官中富集超標(biāo)的銅后，就會出現(xiàn)溶血性黃瘟、腎功能衰竭等癥狀[3]，對人體造成嚴(yán)重的傷害[4]。重金屬污染治理的方法多種多樣。微生物繁殖迅速，在直接處理低濃度重金屬廢水或者是二次處理重金屬廢水時，有著修復(fù)效果好、投資小、費用低、易于管理和操作、不產(chǎn)生二次污染的優(yōu)點，因而日益受到人們的重視，成為重金屬污染修復(fù)的研究熱點[5]。目前微生物法處理銅離子污染廢水多處于實驗室階段，如印度學(xué)者Dave等[6]篩選分離得到的Eichhorniaspp.在24 h內(nèi)對100 μg/L的銅離子去除率達到85%，但是這種菌株對銅離子的極限耐受程度卻不夠高。Andreazza等[7]從銅污染的葡萄園土壤篩選到Pseudomenassp.，其在起始濃度為300 mg/L的廢水中，24 h內(nèi)對銅離子的吸附率達到36%，該菌株雖然耐受能力較強，但是吸附能力卻很差。在國內(nèi)，劉婷婷等[8]篩選到的放線菌對銅離子的耐受能力可以達到8 000 mg/L。因此，篩選到銅重金屬離子耐受能力強同時吸附能力也強的菌株，對微生物治理水體重金屬污染具有著一定的積極意義。生物技術(shù)在直接處理低濃度重金屬廢水或者是二次處理高濃度重金屬廢水時，有著投資小、不產(chǎn)生二次污染的優(yōu)點，但是現(xiàn)在的生物治理技術(shù)實驗材料大都是利用工業(yè)發(fā)酵中產(chǎn)生的廢棄菌絲體和自然環(huán)境中的水藻類[9-10]，細菌和真菌類較少。因此，本文期望篩選到能夠在高濃度銅離子環(huán)境中生長并具有高吸附特性的細菌，進而擴充微生物治理銅離子水體污染的備選菌種，為銅離子污染的生態(tài)環(huán)境的生物治理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

土壤樣品為電鍍廠周邊的土壤、廣西大學(xué)碧云湖底的淤泥和廣西大學(xué)垃圾場的土壤。樣品封裝于滅菌后的離心管中，并置于—20℃冰箱備用。

1.1.2 基礎(chǔ)培養(yǎng)基

(1)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(細菌)：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，蒸餾水1 L。

(2)高氏一號(放線菌)：可溶性淀粉20 g，硝酸鉀1 g，氯化鈉0.5 g，磷酸氫二鉀0.5 g，硫酸鎂0.5 g，硫酸鐵0.01 g，蒸餾水1 L，pH值為7.2-7.4。配置時，先用少量冷水將淀粉調(diào)成糊狀，倒入煮沸的水中，在火上加熱，邊攪拌邊加入其他成分，融化后，補充水至1 L。

(3)察氏培養(yǎng)基(霉菌)：硝酸鈉2 g，磷酸氫二鉀1 g，氯化鉀0.5 g，硫酸鎂0.5 g，硫酸鐵0.01 g，蔗糖30 g，蒸餾水1 L。

(4)馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基(真菌)：葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，磷酸二氫鉀1 g，七水合硫酸鎂0.5 g，1%虎紅300 μL，蒸餾水1 L。

葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏等試劑藥品均為市售分析純。(1)(2)(3)號培養(yǎng)基在121℃下滅菌20 min，(4)號培養(yǎng)基在112℃下滅菌20 min。

1.1.3 含重金屬離子的培養(yǎng)基

1.1.2節(jié)(1)(2)(3)(4)基礎(chǔ)培養(yǎng)基滅菌后加入無菌的氯化銅溶液(使用孔徑0.22 μm的濾膜過濾除菌)，使其達到實驗所設(shè)計的濃度。需要配制固體培養(yǎng)基時，在上述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入2%的瓊脂即可。

1.2 方法

1.2.1 微生物的馴化與篩選

稱取5 g土壤樣品加入到45 mL的無菌水中，加入適量玻璃珠，220 r/min充分震蕩20 min，分散孢子，靜置5 min后取上清液。將上清經(jīng)過105倍梯度稀釋后，接種到已滅菌的含有10 mmol/L銅離子的固體平板培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細菌培養(yǎng)溫度為37℃，培養(yǎng)時間為1 d；真菌、放線菌為28-30℃，培養(yǎng)時間分別為3-5 d和5-7 d。待微生物生長出來后，挑單菌落至裝有滅菌的5 mL液體培養(yǎng)基中，恒溫搖床振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為220 r/min。菌種經(jīng)過培養(yǎng)后按5%的接種量，依次接種于銅離子濃度為20-300 mmol/L的新鮮液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)搖床振蕩培養(yǎng)。如此通過不斷提高培養(yǎng)基中的銅離子濃度對土壤中耐受重金屬的微生物進行馴化[11]。

1.2.2 菌株的分離純化

選取對銅離子耐受性最好的菌株，在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在無菌操作的條件下，將菌液經(jīng)過一定濃度的稀釋，在不含重金屬離子的固體培養(yǎng)基上劃線分離，培養(yǎng)5 d后觀察菌落形態(tài)。用平板培養(yǎng)基再轉(zhuǎn)接培養(yǎng)分離純化3次，以達到菌株徹底純化的效果。純化的菌株保存于—20℃冰箱中備用。

1.2.3 菌種鑒定

(1)細菌基因組DNA的提取參考文獻[12]。

(2)細菌16S rDNA的PCR擴增

PCR反應(yīng)體系為50 μL。其中基因組DNA 1 μL作為反應(yīng)模板，上下游引物混合物(正向引物5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′，反向引物5′-TCAGGTTACCTTGTTACGTACTT-3′)1 μL，dNTP混合物4 μL，rTaq聚合酶0.5 μL，10×緩沖液5 μL，加滅菌的去離子水至50 μL。

PCR反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性1 min；98℃變性10 s，55℃復(fù)性10 s，72℃延伸1.5 min，35個循環(huán)；72℃延伸7 min。通過膠回收試劑盒純化、回收擴增的DNA，送至廣州睿博進行16S rDNA測序。

1.2.4 菌株生長特性測定

配制細菌培養(yǎng)基，設(shè)定pH值(4，5，6，7，8，9)、銅離子濃度(0,25,50,100,150,200 mg/L)、溫度等3個因素，進行單因素實驗，對其生長過程中的OD值與生長速率μ值(即為單位時間內(nèi)菌株的絕對生長量，用于量化對數(shù)生長期的峰值生長速度)進行研究，以摸索出菌株的最佳生長環(huán)境，測定不同因素下菌體的生長情況，并測定在無銅離子、自然pH值、37℃條件時的標(biāo)準(zhǔn)生長曲線。生長曲線測定由rts儀器測定(測定波長800 nm，測定時轉(zhuǎn)速2 000 r/min)。

1.2.5 吸附特性研究

(a)吸附試驗[13]：配制細菌液體培養(yǎng)基，在250 mL三角瓶中加入100 mL液體培養(yǎng)基，滅菌后接入1 mL菌懸液，然后置于37℃、220 r/min搖床中培養(yǎng)16 h。使用吸附體系pH值(5，6，7，8，9)、吸附時間(2,4,6,8 h)、起始銅離子濃度(50,100,150,200 mg/L)、吸附溫度(25,30,35,40,45℃)等4個因素設(shè)置單因素實驗，對其進行吸附特性研究，實驗處理之后的培養(yǎng)液經(jīng)8 000 r/min冷凍離心，取上清液使用銅試劑法測其銅離子濃度，吸附率(%)=(Cu2+初始濃度—Cu2+終濃度)/Cu2+初始濃度×100%。

(b)銅離子測定[14]：銅離子在溶液中可以和二乙基二硫代氨基甲酸鈉生成有色絡(luò)合物，當(dāng)水樣中銅離子濃度較高時，可在水相中直接測定，其最大吸收波長為450 nm，在測定條件下有色絡(luò)合物可穩(wěn)定1 h。將未經(jīng)酸化的水樣，通過0.45 μm濾膜過濾。用移液管移取適量的體積(含銅量不超過35 μg，最大加入體積不大于50 mL；若含銅量超過35 μg，則應(yīng)該稀釋一定倍數(shù)至含銅量小于35 μg)過濾后的試樣，置于分液漏斗中，加水至50 mL。加入5.0 mL二乙基二硫代氨基甲酸鈉溶液(ρ=2 mg/mL)，搖勻，靜置5 min，準(zhǔn)確加入10 mL四氯化碳，震蕩不少于2 min，靜置分層。顯色后1 h內(nèi)，使用紫外吸收分光光度計測定吸光值。

(c)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：在8個分液漏斗中分別加入含有0,6.4,12.8,19.2,25.6,32 μg的銅離子標(biāo)準(zhǔn)溶液，加水至50 mL總體積，配成系列校準(zhǔn)溶液，使用銅試劑測定方法，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)實驗數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，銅離子標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=104.89x-6.498，R2=0.999 7。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離純化與鑒定

按照1.1.1節(jié)所述配制含銅離子的固體篩選平板，將土壤樣品處理后稀釋涂布，篩選馴化后發(fā)現(xiàn)，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生長的一株菌株對銅離子的耐受最高，如圖1所示其耐受銅離子濃度最高可以達到19 000 mg/L，命名為KCY。之后按照1.2.3節(jié)所述，提取細菌KCY總DNA，并擴增其16S rDNA序列，其擴增產(chǎn)物如圖2所示。通過膠回收，擴增的產(chǎn)物由廣州瑞博公司進行測序，獲得16S rDNA的基因序列。將該序列與NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對，使用MEGA 7軟件里面的最大似然法構(gòu)建進化樹[15-16]，進化樹分析如圖3所示，發(fā)現(xiàn)細菌KCY與Bacillussubtilis的同源性大于96%，可以確定該菌為枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis，命名為BacillussubtilisKCY。

圖1 菌株耐受情況

圖2 菌株 16S rDNA 瓊脂糖凝膠電泳圖

Fig.2 Agarose gel electrophoresis of 16S rDNA of the strain

圖3 菌株的進化樹分析

2.2 菌株的生長特性

2.2.1 菌株生長曲線

由圖4a可知，該菌株的生長周期較短，在37℃條件下培養(yǎng)3 h后就進入對數(shù)生長期，峰值生長速率可達1 h-1；11 h時進入穩(wěn)定期，峰值OD800可達7；14 h后就進入衰亡期，OD800開始下滑；16 h后菌株OD800下滑速度開始減緩，最后OD800下降到一定數(shù)值便不再變化。對應(yīng)的生長速率圖也可以看出相應(yīng)的結(jié)果(圖4b)。

圖4 菌株生長曲線(OD800與生長速率)

2.2.2 pH值對菌株生長特性的影響

由圖5可知，pH值為8時菌株的峰值OD800最高，可以達到7.84(圖5a)；在此pH值條件下，菌株的對數(shù)生長期峰值生長速率也最大，可以達到1.1 h-1左右(圖5b)，此條件應(yīng)該是菌株生長的最佳pH值。在pH值分別為6和7時，菌株穩(wěn)定期的OD800與pH值為8時相差不大，但是pH值為6時，菌株的對數(shù)生長期峰值生長速率偏低，僅為0.8 h-1左右。當(dāng)pH值為5和9時，菌株整個生長期的OD800明顯偏低，對數(shù)生長期生長速率相較于pH值為8時都有一定程度的下降。因此推測菌株生長的最佳pH值為6-8，在此范圍下菌株可以較好地生長。其中，當(dāng)pH值為8時菌株生長狀態(tài)最好。

圖5 pH值對菌株生長的影響(OD800與生長速率)

Fig.5 Effect of pH value on strain growth (OD800and growth rate)

2.2.3 溫度對菌株生長特性的影響

如圖6所示，菌株在25-40℃可以較好地生長，峰值OD800都可以達到7以上，當(dāng)溫度為30℃時菌株峰值OD800最高(圖6a)，對數(shù)生長期的峰值生長速率也最高，可以達到0.9 h-1左右(圖6b)。當(dāng)溫度為40℃時，可以看到菌株的生長周期大大縮短，在15 h左右時，菌株就進入衰亡期，而此時其他溫度條件下的菌株還沒有進入穩(wěn)定期。在溫度大于等于45℃或小于等于20℃時，菌株已經(jīng)不能正常生長。

2.2.4 初始銅離子濃度對菌株生長特性的影響

由圖7可知，菌株在初始銅離子濃度為25 mg/L時，OD800相較于正常情況下就已經(jīng)開始下降，但下降幅度不多，基本可以正常生長，而對數(shù)期生長速率卻有較大下滑，表明菌株的生長還是一定程度受到銅離子的影響。當(dāng)初始銅離子濃度開始增加，菌株的生長開始受到抑制。當(dāng)銅離子濃度達到150 mg/L時，菌株的4個生長時期已經(jīng)基本不能區(qū)分，此時菌株受到強抑制，不能正常生長。

圖6 溫度對菌株生長的影響(OD800與生長速率)

Fig.6 Effect of temperature on strain growth(OD800and growth rate)

圖7 初始銅離子濃度對菌株生長的影響(OD800與生長速率)

Fig.7 Effect of initial copper concentration on strain growth (OD800and growth rate)

2.3 菌株的吸附特性

2.3.1 吸附時間對菌株吸附特性的影響

由圖8可知，在起始銅離子濃度為200 mg/L條件下,吸附5 h，枯草芽孢桿菌KCY對銅離子的吸附率達到最高(72%)，之后吸附率便開始下降。值得注意的是，在最初的1 h內(nèi)，菌株對銅離子的吸附率就已達到40%，這可能與吸附剛開始時，菌株吸附位點空余有關(guān)。在2 h后，吸附率增長緩慢，應(yīng)該是因為表面空余位點都被占據(jù)，此時只有主動吸附起作用，所以增長緩慢，直到第5 h 達到峰值(72%)，之后吸附效率便開始大幅度下滑。

圖8 吸附時間對菌株吸附能力的影響

Fig.8 Effect of adsorption time on adsorption capacity of strain

2.3.2 吸附溫度對菌株吸附特性的影響

由圖9可知，枯草芽孢桿菌KCY在20-25℃時，對重金屬離子的吸附能力非常弱，可能是由于較低的溫度影響吸附活性物質(zhì)的合成[17]。當(dāng)溫度為30-40℃時，吸附效率逐漸上升，40℃到達峰值，之后開始下降，可能是過高的溫度使菌株的吸附活性成分受到損傷。

圖9 吸附溫度對菌株吸附能力的影響

Fig.9 Effect of temperature on adsorption capacity of strain

2.3.3 pH值對菌株吸附特性的影響

由圖10可知最佳pH值為7，此時枯草芽孢桿菌KCY的吸附率達到最高(72%)。偏酸環(huán)境影響吸附效率，可能與溶液中的H+和H3O+占據(jù)吸附位點有關(guān)；偏堿環(huán)境影響吸附效率可能與溶液中形成Cu(OH)2有關(guān)。

圖10 pH值對菌株吸附能力的影響

Fig.10 Effect of pH value on adsorption capacity of strain

2.3.4 起始銅離子濃度對菌株吸附特性的影響

由圖11可知，起始銅離子濃度為150,200,250 mg/L時，菌株吸附率都在70%左右，而在銅離子濃度為200 mg/L時枯草芽孢桿菌KCY吸附率達到最大(72%)。銅離子濃度超過250 mg/mL時，吸附能力開始下滑。當(dāng)銅離子濃度超過300 mg/mL時，這種吸附能力的下滑開始變得緩慢。菌株的吸附率隨著起始重金屬銅離子的濃度增大而增大，可能是由于細胞壁上的結(jié)合位點較多，在銅離子濃度較低時沒有完全與這些吸附位點結(jié)合。

圖11 起始銅離子濃度對菌株吸附能力的影響

Fig.11 Effect of initial copper concentration on adsorption capacity of strain

3 討論

對BacillussubtilisKCY進行吸附特性研究，摸索出最佳吸附pH值為7。培養(yǎng)環(huán)境過堿性時，溶液內(nèi)會形成氫氧化銅沉淀，影響吸附；而當(dāng)培養(yǎng)環(huán)境偏酸性時，溶液內(nèi)存在大量帶正電的氫離子，這些帶正電的氫離子會與溶液中游離的銅離子競爭活性吸附位點，因此會影響菌體對于銅離子的吸附；與此同時，氫離子與細胞表面細胞壁的吸附位點結(jié)合后，使得細胞壁表面的—COOH、—OH等官能團質(zhì)子化而帶上正電荷，由于同性相斥的靜電斥力進一步限制帶正電金屬離子的靠近與吸附。

在吸附起始1 h內(nèi)，吸附剛開始的時候，菌株里面所有的吸附位點都是空的，且溶液中金屬離子的濃度含量比較高，質(zhì)粒之間推動力非常大，所以吸附起來很快；隨著吸附逐漸進行，菌體的細胞外部細胞壁上面的吸附位點被逐漸占滿，未吸附的活性位點減少，所以金屬離子吸附量的增加變得非常慢[18-19]。而且吸附的初始階段來說，主要是金屬離子和細胞壁表面的—COOH、—OH等官能團相結(jié)合，這種類型的吸附往往非常迅速[20-21]；隨著吸附的進行，重金屬銅離子通過細胞的主動吸附進入細胞，細胞內(nèi)的區(qū)隔作用開始顯現(xiàn)，細胞壁上的重金屬離子逐漸被轉(zhuǎn)移至細胞內(nèi)部，細胞外壁上的活性位點又開始暴露出來，所以吸附量還可以進一步增加。但由于這個過程非常緩慢，所以吸附率的增加也變得很緩慢[17-18,22]。而之后的吸附率下降，猜測可能是因為重金屬離子對菌株造成損傷，導(dǎo)致一些細胞開始分解，細胞量下降，所以吸附能力也開始下降。

從實驗結(jié)果可以看出，菌株的吸附率隨著起始重金屬銅離子的濃度增大而增大，可能是開始時由于細胞壁上的結(jié)合位點較多，在銅離子濃度較低的時候不能完全與這些吸附位點結(jié)合，所以隨著起始銅離子濃度的增大，吸附率也逐漸增大。還有一個可能的原因是當(dāng)溶液中銅離子的濃度增大時，溶液中游離的銅離子間也會產(chǎn)生相當(dāng)?shù)呐懦庾饔?，使得銅離子更容易與細胞壁表面上的吸附位點結(jié)合，也就是說，重金屬濃度的增加使得銅離子在溶液與微生物吸附劑之間的傳質(zhì)推動力增加，導(dǎo)致吸附率變大[23]；然而，隨著重金屬銅離子濃度的進一步增加，重金屬離子逐漸將細胞壁上的活性吸附位點全部占據(jù)，可利用的吸附位點減少，吸附率就呈現(xiàn)出降低的現(xiàn)象[21,23-24]。從圖11中可以看出，當(dāng)銅離子起始濃度超過200 mg/L時吸附率開始下降，但是經(jīng)過計算可以發(fā)現(xiàn)，菌株吸附銅離子的總量卻是在增加的。

在20℃和25℃時，菌株吸附率較低，推測可能是由于較低的溫度影響吸附活性物質(zhì)的合成[17]。當(dāng)溫度逐漸升高到30，35，40℃時，枯草芽孢桿菌KCY的重金屬離子吸附能力逐漸上升。根據(jù)之前的優(yōu)化發(fā)酵條件也可以看出，枯草芽孢桿菌比較適合35-40℃的溫度環(huán)境，在這樣的環(huán)境下，相對高的溫度加速菌株體內(nèi)的新陳代謝，使得菌株的胞內(nèi)吸附作用得到活化，所以提高了菌株對重金屬離子的吸附能力。而當(dāng)溫度繼續(xù)升高到45℃時，枯草芽孢桿菌KCY的吸附能力開始下降，說明溫度過高，對菌體內(nèi)的一些生物質(zhì)產(chǎn)生傷害，使得菌體的吸附能力下降。

微生物修復(fù)法在直接處理低濃度重金屬污染水體或者是二次處理重金屬污染水體時，相較于傳統(tǒng)物理法、化學(xué)法有著更為高效、綠色的優(yōu)點，其修復(fù)潛力巨大[25]。現(xiàn)階段雖然已有耐銅微生物的報道，但其耐受性還不是很強,如PseudomonasUSTB-E、Aspergillusfumigatus、Providenciaalcalifaciens、Rhizopus的耐受濃度分別為560 mg/L[26]， 940 mg/L[27]，450 mg/L[28]， 1 920 mg/L[29]。本實驗篩選到的枯草芽孢桿菌對銅離子耐受濃度可以達到19 000 mg/L，是已發(fā)現(xiàn)的耐受微生物中較為優(yōu)秀的菌種。菌株P(guān)rovidenciaalcalifaciens在銅離子起始濃度為100 mg/L、pH值為5.5、溫度為30℃、吸附時間為4 h的條件下，達到最大吸附效率82%[28]，本實驗菌株吸附效率與之相差不大，但在耐受性方面，從450 mg/L提升到19 000 mg/L，更能適應(yīng)于高濃度的污染廢水，擴增了微生物修復(fù)的菌株備選庫，有利于以后微生物治理廢水的工業(yè)化生產(chǎn)。

4 結(jié)論

篩選到的枯草芽孢桿菌KCY在溫度25-40℃，pH值為5-9時，可以基本正常生長；其最佳發(fā)酵條件為30℃，pH值為8；保持基本正常生長下的銅離子耐受濃度為0-150 mg/L，極限銅離子耐受濃度可以達到19 000 mg/L，吸附率可以達到72%。對于銅離子的最佳吸附條件為pH值7，溫度40℃，起始銅離子濃度200 mg/L，吸附5 h。實驗篩選到的菌株具有改善和治理銅離子污染廢水的潛力。