劉瑞媛，金文杰，曲 穎，周利斌，董喜存，李文建

(中國科學院近代物理研究所生物醫(yī)學中心，甘肅蘭州 730000)

0 引言

重離子束輻射誘變技術作為植物種質創(chuàng)新的有力工具，目前已廣泛應用到作物育種及功能基因的研究中。重離子束作為一種新的輻射源，與X射線、60Co-γ射線、電子束輻照等輻照技術相比，具有傳能線密度(Linear Energy Transfer,LET)大、相對生物學效應(Relative Biological Effectiveness,RBE)高、損傷后修復效應小、能量沉積的空間分辨性好等生物學優(yōu)勢，因此可以在存活率較高的情況下得到較高的突變率。目前重離子束輻射誘變已涉及糧食作物如小麥、玉米、水稻等，經濟作物如油葵、甜高粱、番茄等，以及觀賞植物天竺葵、大麗花、白花紫露草等，并取得很大的進展。本文就重離子束輻照在植物育種中的應用進行簡要概述。

1 重離子束輻照的優(yōu)勢

重離子是指氮、碳、硼、氖、氬等原子被剝掉或部分剝掉外圍電子后的帶正電的原子核。將重離子通過大型加速器裝置加速而形成的具有能量的射線就是重離子束。相對于低能射線(X射線和γ射線)，重離子束具有獨特的深度-劑量曲線，形成布拉格(Bragg)峰(圖1)，即重離子在入射坪區(qū)，吸收劑量相對保持恒定，坪區(qū)的長度取決于入射重離子的能量，快到射程末端時，劑量急劇升高，形成Bragg峰。Bragg峰會隨著原子序數(shù)的增加而變窄，同時峰的高度也增加[1]。正是由于重離子的這種物理學特性，更有利于實現(xiàn)定點誘變，在植物育種過程中將需要誘變的部位設定在Bragg峰的范圍內進行輻照，能達到輻射誘變的效果，進而篩選突變體進行后期的研究。

圖1 光子、X射線、60Co-γ射線、碳離子的深度劑量曲線[1]

Fig.1 Curve of the depth dose profiles of photon,X-rays,60Co-γ and carbon ions[1]

重離子束作為一種新的輻射源，與X射線、60Co-γ射線、電子束輻照等輻照技術相比，具有獨特的生物學優(yōu)勢。(1)傳能線密度(LET)大。LET是指直接電離粒子在其單位徑跡上消耗的平均能量，一般用keV/μm表示，1 keV/μm=1.602×10-10J/m。重離子束在穿越介質的過程中將其能量(單位路徑上沉積的能量)以較快的速率沉積在粒子徑跡上。而X射線、60Co-γ射線、電子束在單位徑跡上沉積的能量較低，因此LET值也較低。故通常將X射線、60Co-γ射線、電子束等稱為低能射線，而將重離子束稱為高能射線。一般來說，LET值越高，其生物學效應也越大。(2)相對生物效應(RBE)高。電離輻射的生物效應，不僅取決于某一特定時間內吸收的總劑量，而且還受能力分布的制約。在劑量相同時，高LET輻射的生物效應大于低LET的輻射效應，這種差別一般用相對生物學效應來表示。故重離子的相對生物學效應高于其他低能射線。(3)損傷后修復效應小。(4)能量沉積的空間分辨性好。(5)氧效應小。已有研究表明，重離子束輻射引發(fā)的總突變效率要比通常的低能射線(X射線、60Co-γ射線和電子束)高出10倍左右[2]，染色體突變重排和誘導點突變的效率比常見的低能射線高13-14倍。

因此，利用重離子束上述生物學特性，就可以在輻照劑量相對較小的情況下達到預期的生物學效應。這些優(yōu)勢在植物誘變育種工作中有很大的作用，為植物科學研究提供新的方向。

2 重離子輻照的植物誘變機理

近年來，以重離子輻照誘變?yōu)榛A的植物育種不斷發(fā)展，對重離子誘變機理的研究也越來越受重視。

2.1 重離子輻照對植物表型的影響

利用重離子束輻射產生的、在植株表型變化的突變類型主要包括葉色、葉型、花型、花色、株型、生長周期突變等。Du等[3]利用不同劑量的碳離子輻照擬南芥(Arabidopsisthaliana)干種子，獲得了葉型、株型、花型、生長周期突變的擬南芥突變體，表現(xiàn)出比低能射線輻照更多的變異種類，總突變率為4.77%，其中葉型變異占總突變的2.33%，生長周期變化占總突變的1.57%。Okamura等[4]利用重離子輻照菊花(Dendranthemamorifolium(Ramat.)Tzvel.)選育出重瓣突變體。此外，Luo等[5]通過碳離子束輻照百脈根(LotuscorniculatusLinn.)種子，其后代出現(xiàn)葉色、葉型、花型、產量、株型、分蘗以及花期等突變體，總突變率達5.14%。以上研究表明，重離子輻照對植物表型的影響是多樣化的，利用重離子輻照技術可以拓寬和加速作物優(yōu)良農藝性狀的選育。

2.2 重離子束輻照對植物生理生化特征的影響

重離子輻照植物所引起的生理生化方面的影響主要表現(xiàn)為生物體內活性氧和可溶性糖含量的增加[6]，產生的機制包括兩個方面：(1)重離子束輻照靶材料(如種子、愈傷組織、幼嫩枝條等)時，輻照可以使H2O分解為·OH和·H兩種自由基，由于自由基自身極強的氧化或還原特性，進而引發(fā)各種反應，形成新的分子或其他類型的自由基以及活性氧分子。(2)重離子輻射造成植物染色體及細胞膜的破壞，促使植株進行自身修復，誘發(fā)體內活性氧及可溶性糖的增加。不同植物中，不同劑量輻照后對植株體內可溶性糖及活性氧相關酶活性的影響不同。李雪虎等[7]利用不同劑量的碳離子輻照大青葉，結果表明可溶性糖的含量隨著輻照劑量的增加而降低，丙二醛(MDA)、SOD、POD的含量呈先升高后降低的趨勢。薛林貴等[8]用12C6+離子束輻照紫蘇種子，發(fā)現(xiàn)其當代的POD、CAT以及SOD三種酶活性均有不同程度的提高，但當輻射劑量過大時，酶活性反而降低。其進一步說明植物通過自我調節(jié)機制來增強細胞抗氧化酶活性來增強自身抗氧化和抵御逆境的能力，從而減輕逆境對植物的傷害，保證生理代謝的正常進行。

2.3 重離子束輻照對植物分子水平的影響

重離子束輻射一方面改變了植株體內基因序列、DNA結構及表達方式，另一方面改變了植物體內甲基化、轉座子以及蛋白結構，進而引起植株發(fā)生突變。Du等[9]利用重測序的方法檢測了M3代擬南芥突變體，結果表明重離子束輻照引起的DNA堿基替換的數(shù)目遠遠多于插入/缺失，同時，單堿基缺失的數(shù)目多于大片段缺失。Zhao等[10]利用不同劑量碳離子輻照處理水稻后，發(fā)現(xiàn)DNA甲基化多態(tài)性水平在不同劑量處理后均有所提高，且高劑量輻射引起的DNA甲基化較低劑量輻射更加明顯。此外，基因組DNA的甲基化與轉座子的激活有著密切的聯(lián)系，轉座子不但是DNA甲基化作用的靶位點，還可以通過轉座來影響其他位點甲基化的產生。利用N離子注入玉米種子，研究結果表明，玉米突變體TIRA和TIRB末端，CpG、CpHpG和CpHpH胞嘧啶位點較野生型均發(fā)生不同程度的甲基化，從而激活MuDR轉座元件[11]。

3 重離子束輻射誘變技術在植物育種中的應用

3.1 重離子束誘變育種在國際上的應用

重離子束在核物理方面的研究始于20世紀70年代日本、美國等國家加速器裝置的建設。直至1993年，日本建立了世界上首個專門應用于生物學研究的回旋加速器環(huán)(RIKEN Ring Cyclotron，RRC)，重離子束輻射效應的研究才被應用到植物的誘變育種中[12]。重離子通過加速器注入植物外植體內，同材料中的分子、原子發(fā)生碰撞，能在局部區(qū)域釋放出高能量，顯著誘導單鏈或雙鏈DNA斷裂、DNA交聯(lián)改變、末端受損以及簇集損傷，從而導致DNA在復制過程中出現(xiàn)錯配現(xiàn)象，使其不容易修復。同時，重離子束輻射也會引起染色體的變化，包括染色體結構和數(shù)目的變化，尤其是染色體數(shù)目的變化在植物育種中多倍體材料的選育具有重要的意義。因此，重離子束輻射是一種很有效的誘導植物改良的技術手段，可以有效地改變目標性狀，能在不影響其他特征的基礎上提供一個廣譜的變異范圍，從而獲得很多新穎的表型[13]。

日本育種學家將重離子束輻照誘變技術與傳統(tǒng)育種技術相結合(圖2)，獲得擬南芥、百脈根、水稻以及花卉等一系列突變材料[14]。模式植物方面，Tanaka等[15]利用重離子束輻照篩選出抗UV-B、UV-B敏感、紫紅色斑點種皮以及葉綠素缺失的擬南芥突變體；豆科模式植物百脈根通過離子束輻照處理篩選到根部結瘤能力提高、維管組織和花器官發(fā)育異常的突變體[16]。糧食作物方面，水稻種子經重離子輻照后，獲得種子中鎘積累減少、早熟、矮化、白化的突變體[17-18]。花卉方面，2001年在廣島上市的大麗花(DahliapinnataCav.)“World”品種，就是大麗花枝條經碳輻照后，選育的花型花色改變的大麗花新品種。馬鞭草(Verbena)“Temari Coral Pink”的愈傷組織經1 890 MeV氮離子在10 Gy劑量下輻照后，篩選到花色變粉、花期延長且不育新品種“Temari Bright Pink”(2002年)[19]。同理獲得的品種還有矮牽牛(Petuniahybrida(J.D.Hooker) Vilmorin)“Surfinia Rose Veined”(2003年)和“Surfinia Pure White”(2012年)兩種新品種、夏堇(ToreniafournieriLinden.ex Fourn.)新品種“Summer Wave Pin”(2007年)等。此外，對這些突變材料進行重離子的二次輻照誘變，又篩選到一些新的突變材料。一些學者在遺傳學和分子生物學層面分析了突變材料的變異機理，進而深入探索重離子束對植物誘變育種的機理[20-22]。

3.2 重離子束誘變育種在國內的應用

重離子植物誘變育種在我國最先開展于糧食作物。1986年余增亮等[23]將氮離子注入水稻干種子，并進行生物學效應研究，提出離子注入能量沉積、質量沉積以及電荷轉移引起生物學效應的假說，填補了我國重離子誘變育種領域的空白。安徽省農業(yè)科學院利用重離子束注入技術輻照水稻種子，育成抗病蟲水稻S9042、優(yōu)質水稻S9055、早熟高產中粳63和晚粳M3122等品種，取得巨大的社會和經濟效益[24]；隨后又利用重離子輻照誘變小麥，培育出3個小麥新品種(皖麥32號、皖麥42號和皖麥32號)，產量較對照均顯著提高，綜合性狀和抗病性也有所改良[25]。羅紅兵等[26]分別利用鋰和碳離子束誘變玉米農大108種胚，從輻照當代植株中篩選出葉片黃化、雄性不育、早熟和無雄穗等突變材料，從M2代中篩選出多穗等突變體，擴大了玉米的種質資源，為新品種的選育提供了寶貴基礎材料。此外，重離子束輻照技術在煙草、大豆、甘薯、番茄、西瓜中也得到應用并獲得多種突變材料。

(a)重離子束輻照誘變無性繁殖流程

(a)Mutants screening scheme by heavy ion beam irradiation with vegetative propagation

(b)重離子束誘變有性繁殖流程

20世紀90年代開始，中國科學院近代物理研究所利用蘭州重離子加速器(HIRFL)裝置提供的重離子束開展一系列植物誘變育種工作，涉及作物[27-29]、中草藥[30]和花卉[31]等方面。在作物方面，小麥干種子經重離子輻照后，經多代田間選育，育成高產、穩(wěn)產、抗逆的小麥新品種“隴輻2號”[27]；甜高粱干種子經碳離子輻照后，經多代田間篩選，獲得高產、高糖以及生育期提前的甜高粱新品種“近甜1號”[32]。在中草藥方面，利用重離子輻照當歸、黨參、黃芪等種子后，先后選育出當歸新品種“岷歸3號”、黨參新品種“渭黨2號”和“渭黨3號”以及黃芪新品種“隴芪1號”[33-34]。在花卉方面，利用中能重離子束輻照矮牽牛干種子，種植后篩選到花瓣由單瓣變?yōu)殡p瓣的花型突變株以及花色由淺紅變?yōu)樯罴t的花色變異株；萬壽菊干種子經低能N、C離子輻照后，出現(xiàn)了花盤增大的變異株[35]；2005年，將大麗花花芽經碳離子輻照后，篩選出矮化、花期提前以及花色變化的變異單株，經過穩(wěn)定性試驗后獲得“新興紅”和“新興白”2個大麗花新品種[36]；Wu等[31]利用80.55 MeV 的碳離子輻照一串紅干種子后，在100 Gy劑量下篩選出植株矮化、葉片變皺、花色變?yōu)樯罴t色以及嵌合色變異植株。綜上，重離子輻射誘變技術對提高作物誘變育種的效率及相應關鍵基因功能的研究具有重要的意義。

4 展望

突變體創(chuàng)制在植物機理研究和作物育種研究中起到非常重要的作用，開發(fā)高效的誘導突變體技術是作物遺傳育種及基因功能研究的基礎。重離子輻射誘變技術因其突變譜廣、操作簡單、變異多等特點，已廣泛應用于作物育種及關鍵基因的功能研究工作中。然而，重離子輻射誘變的機制復雜，不同類型的重離子和不同離子劑量產生的誘變效應不同，不同作物的耐受劑量也不同，因此，選擇適宜的重離子及其劑量是高效創(chuàng)制突變體的關鍵。在誘變機理研究方面，隨著測序技術的不斷發(fā)展，將重離子輻射技術與基因重測序、轉錄組測序、蛋白質組等技術結合，可深入研究重離子輻射誘變后的分子機制，進一步闡明重離子輻射誘變的機理。