張高陽，丘佳韻，彭佳佳，汪學(xué)榮

（西南大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，重慶402460）

皮蛋作為我國傳統(tǒng)再制蛋加工制品之一，別名有松花蛋、變蛋、彩蛋等。皮蛋的風(fēng)味獨(dú)特，香醇可口，并且營養(yǎng)成分豐富，含有大量的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、維生素和微量元素，具有易吸收、清熱解毒等特點(diǎn)，從而受到大眾的喜愛[1]。但隨著人們食品健康安全意識(shí)的逐步提高，傳統(tǒng)的皮蛋生產(chǎn)制造工業(yè)面臨著極大的挑戰(zhàn)，同時(shí)在生產(chǎn)工藝方面也有很多地方有待改進(jìn)。例如生產(chǎn)加工中使用的氧化鉛（lead oxide，PbO）危害人體健康[2]，咸蛋黃生產(chǎn)過程中蛋白過咸，油脂的抗氧化能力下降，不宜食用[3]，但如果丟棄在環(huán)境中，容易造成蛋白質(zhì)資源的極大浪費(fèi)。另外傳統(tǒng)皮蛋加工過程中的深加工程度、原料蛋品質(zhì)、生產(chǎn)技術(shù)的先進(jìn)性等問題也值得大家反思，因此對(duì)于如何優(yōu)化生產(chǎn)流程，提高生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本、減少破損率就成為了困擾廣大蛋制品生產(chǎn)廠家的“心病”[4-5]。

目前對(duì)蛋清蛋白堿誘導(dǎo)的研究主要集中于對(duì)蛋白質(zhì)濃度、pH值、加熱溫度、加熱時(shí)間等諸多單一因素的影響[6]。例如一些學(xué)者研究了蛋清在酸、堿作用下的凝膠化現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)蛋清在pH 2.3以下或pH 12.0以上都會(huì)形成凝膠，在pH 2.3～12.0之間則不發(fā)生凝膠化[7]。此外，Croguennec等[8]研究發(fā)現(xiàn)不同的金屬離子pH值對(duì)蛋清蛋白質(zhì)凝膠性能有顯著影響；pH值為7時(shí)，F(xiàn)e3+、Ca2+和Mg2+能影響凝膠的粘彈性和微觀結(jié)構(gòu)且Fe3+最為顯著；而高濃度的氯化鈉（sodium chloride，Na-Cl）能降低凝膠的持水力。但直到如今科研人員對(duì)通過控制多因素來優(yōu)化蛋清蛋白堿誘導(dǎo)凝膠，促進(jìn)凝膠結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性的研究仍有欠缺[9]。通過一系列預(yù)試驗(yàn)和理論分析，擬將蛋清和蛋黃分離，蛋清用作皮蛋的原材料，蛋黃則用來制作咸蛋黃等其他產(chǎn)品。直接向蛋清中加入一定量的可食用堿[10]，這樣做既能簡化工藝流程，縮短生產(chǎn)周期，又能節(jié)約成本，與傳統(tǒng)皮蛋及其制品的加工工藝相比，生產(chǎn)效率得到了顯著提高。本試驗(yàn)以蛋清為原料，將食用堿與蛋清直接混合，通過響應(yīng)面法優(yōu)化蛋清蛋白堿法凝膠化工藝條件[11]。算出最佳響應(yīng)值。以期為提高皮蛋及其系列制品生產(chǎn)效率提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和有益參考。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮雞蛋：榮昌地區(qū)市售，檢驗(yàn)合格；氫氧化鈉（sodium hydroxide，NaOH）（食用級(jí)）：衢州市博特化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

磁力加熱攪拌器（BNCH78-1型）：武漢格萊莫檢測(cè)設(shè)備有限公司；凝膠強(qiáng)度測(cè)試儀（MD-NJ-5型）：臨安豐源電子有限公司；電子分析天平（FA1204B型）：上海建恒儀器有限公司；離心機(jī)（H3-18KR型）：湖南可成儀器有限公司；電熱恒溫干燥烘箱（DGH-9140A型）：上海精宏實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋（SSY6型）：金壇市富華儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 NaOH用量對(duì)蛋清蛋白堿誘導(dǎo)凝膠性質(zhì)的影響

以蛋清質(zhì)量為計(jì)算基準(zhǔn)，分別添加0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%食用級(jí)NaOH于蛋清中，置于40℃恒溫水浴鍋中靜置反應(yīng)3.5 h，冷卻至室溫（25℃），測(cè)定其凝膠強(qiáng)度和持水力。

1.3.2 凝膠化溫度對(duì)蛋清蛋白堿誘導(dǎo)凝膠性質(zhì)的影響

以蛋清質(zhì)量為計(jì)算基準(zhǔn)，添加1.2%的NaOH，將蛋清蛋白分別置于 36、38、40、42、44℃恒溫水浴鍋中靜置反應(yīng)3.5h，冷卻至室溫（25℃），測(cè)定其凝膠強(qiáng)度和持水力。

1.3.3 凝膠化時(shí)間對(duì)蛋清蛋白堿誘導(dǎo)凝膠性質(zhì)的影響

以蛋清重量為計(jì)算基準(zhǔn)，添加1.2%的NaOH，將蛋清蛋白置于40℃恒溫水浴鍋中分別靜置反應(yīng)2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 h，冷卻至室溫（25 ℃），測(cè)定其凝膠強(qiáng)度和持水力。

1.3.4 蛋清蛋白凝膠化最佳工藝條件的確定

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以凝膠強(qiáng)度為響應(yīng)值，通過三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)確定蛋清蛋白凝膠化的最佳工藝條件。

1.4 測(cè)試指標(biāo)

1.4.1 持水力（water holding capacity，WHC）

取樣品3個(gè)不同部位共10g稱重，用規(guī)格為150×150 mm的濾紙包裹后置于50 mL離心管中，于25℃、3 000 r/min下離心10 min，將稱量紙剝離后再次稱量，計(jì)算公式為：

式中：A為離心前重量，g；B為離心后重量，g。

1.4.2 凝膠強(qiáng)度

采用凝膠強(qiáng)度測(cè)定儀測(cè)定蛋清蛋白凝膠的強(qiáng)度，每個(gè)樣品測(cè)定7次，去除最大、最小值后，取剩余5個(gè)值的平均值作為其凝膠強(qiáng)度。

1.5 試驗(yàn)數(shù)據(jù)收集與處理

2 結(jié)果與分析

2.1 NaOH用量對(duì)蛋清蛋白堿誘導(dǎo)凝膠性質(zhì)的影響

固定凝膠化溫度和時(shí)間，考察NaOH用量對(duì)蛋清蛋白凝膠性質(zhì)的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 NaOH用量對(duì)蛋清蛋白凝膠強(qiáng)度和持水力的影響Fig.1 Effect of sodium hydroxide on gel strength and water holding capacity of egg albumin

圖1表明，隨著NaOH用量的增加，蛋清蛋白的凝膠強(qiáng)度和持水力均呈現(xiàn)先增加后減小的變化，當(dāng)NaOH用量為1.2%時(shí)，蛋清蛋白的凝膠強(qiáng)度達(dá)到最大值0.88 kgf，明顯高于堿添加量較小的樣品（P＜0.05）當(dāng)NaOH用量為1.0%時(shí)，持水力最大值為90.78%。這是由于蛋清蛋白中加入一定量氫氧化鈉后，pH值的增加促進(jìn)了更多的疏水性氨基酸的暴露，從而促進(jìn)蛋白鏈的排斥凝結(jié)，進(jìn)而提高了凝膠性質(zhì)。當(dāng)堿添加量高于1.2%時(shí)，凝膠強(qiáng)度顯著下降（P＜0.05），這是由于加入過量的氫氧化鈉后，強(qiáng)堿性pH值下加熱將會(huì)使發(fā)生熱聚集的蛋白質(zhì)解折疊或降解，從而降低了凝膠性質(zhì)[12]，在強(qiáng)堿性條件下，凝膠的形成時(shí)間短、卵白蛋白更易變性、游離基增加，但是表面疏水性不穩(wěn)定，先增加而后又緩慢下降，從而降低凝膠強(qiáng)度[13]。綜合分析可知，1.2%的NaOH用量為較優(yōu)添加量，應(yīng)采用其進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2 凝膠化溫度對(duì)蛋清蛋白堿誘導(dǎo)凝膠性質(zhì)的影響

固定NaOH用量和凝膠化時(shí)間，考察凝膠化溫度對(duì)蛋清蛋白凝膠性質(zhì)的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 凝膠化溫度對(duì)蛋清蛋白凝膠白凝膠強(qiáng)度和持水力的影響Fig.2 Effect of gelation temperature on gel strength and water holding capacity of egg albumin

圖2表明，隨著凝膠化溫度的增加，蛋清蛋白的凝膠強(qiáng)度和持水力均呈現(xiàn)先增加后減小的變化，當(dāng)凝膠化溫度為40℃時(shí)，蛋清蛋白的凝膠強(qiáng)度達(dá)到最大值0.85 kaf，明顯高于溫度較低的樣品（P＜0.05），持水力達(dá)到最大值90.70%。陳曉等[14]研究發(fā)現(xiàn)蛋清蛋白在25℃加熱時(shí)，便能促進(jìn)隱藏的—SH的暴露和氧化，加快—SH與S—S鍵的相互轉(zhuǎn)化，增強(qiáng)凝膠結(jié)構(gòu)。40℃以后凝膠強(qiáng)度下降不顯著（P＞0.05）這是因?yàn)樵?0℃以后加熱時(shí)，較高的溫度會(huì)破壞蛋白質(zhì)交聯(lián)的氫鍵，阻礙蛋白質(zhì)進(jìn)一步吸附水分。在50℃加熱時(shí)，凝膠還可能因?yàn)榉纸舛椥訹15]。結(jié)合分析可知，凝膠化溫度為40℃為較優(yōu)反應(yīng)溫度，應(yīng)采用其進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化試驗(yàn)。

2.3 凝膠化時(shí)間對(duì)蛋清蛋白堿誘導(dǎo)凝膠性質(zhì)的影響

固定NaOH用量和凝膠化溫度，考察凝膠化時(shí)間對(duì)蛋清蛋白凝膠性質(zhì)的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 凝膠化時(shí)間對(duì)蛋清蛋白凝膠白凝膠強(qiáng)度和持水力的影響Fig.3 Effect of gelation time on gel strength and water holding capacity of egg albumin

圖3表明，隨著凝膠化時(shí)間的增加，蛋清蛋白的凝膠強(qiáng)度和持水力均呈現(xiàn)先增加后減小的變化，當(dāng)凝膠化時(shí)間為4 h時(shí)，蛋清蛋白的凝膠強(qiáng)度達(dá)到最大值0.87 kgf，明顯高于凝膠化時(shí)間較短的樣品（P＜0.05），當(dāng)凝膠化時(shí)間為3.5 h時(shí)，持水力達(dá)到最大值86.93%。當(dāng)時(shí)間超過4 h時(shí)，凝膠強(qiáng)度顯著下降（P＜0.05），這是由于氫氧化鈉與蛋白質(zhì)反應(yīng)時(shí)間過長，過量的堿會(huì)使蛋白質(zhì)帶上較多的負(fù)電荷，從而產(chǎn)生較大的靜電斥力，破壞蛋白質(zhì)分子間的結(jié)合，以及蛋白質(zhì)和水分子間的結(jié)合[16]，使凝膠結(jié)構(gòu)變得松散并液化，使部分結(jié)合水又變回自由水，降低持水力，出現(xiàn)“堿傷”現(xiàn)象[17]。孫靜等對(duì)皮蛋工藝的研究發(fā)現(xiàn)熱處理時(shí)間在0～4 h的持水力、凝膠性質(zhì)、彈性以及硬度較為理想[18]，相對(duì)于熱誘導(dǎo)凝膠最后趨于形成較大的硬度[19]，輕度堿傷的皮蛋也能夠恢復(fù)原本的形態(tài)。綜合分析可知，凝膠化時(shí)間4 h為較優(yōu)反應(yīng)時(shí)間，應(yīng)采用其進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化試驗(yàn)。

2.4 蛋清蛋白凝膠化最佳工藝條件的確定

2.4.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用Design Expert8.0軟件，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以NaOH用量、凝膠化溫度和凝膠化時(shí)間為自變量，以凝膠強(qiáng)度為響應(yīng)值，對(duì)蛋清蛋白凝膠化條件進(jìn)行優(yōu)化，因素水平見表1，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

2.4.2 回歸模型的建立與檢驗(yàn)

使用Design Expert8.0軟件對(duì)表2中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，可得到凝膠強(qiáng)度（y）對(duì)自變量X1（NaOH用量）、X2（凝膠化時(shí)間）、X3（凝膠化溫度）的回歸方程式（1）：

表1 因素水平表Table 1 Factor and level

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results of Box-Behnken

回歸方程方差分析見表3。

表3 回歸方程方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

續(xù)表3 回歸方程方差分析Continue table 3 Variance analysis of regression equation

由表3可知：顯著性檢驗(yàn)：**P＜0.000 1，在 α=0.01水平上差異極顯著，建立的模型與實(shí)際情況較相符，試驗(yàn)誤差小，說明回歸方程能較合理的預(yù)測(cè)凝膠化處理?xiàng)l件對(duì)蛋清蛋白凝膠強(qiáng)度的影響；失擬性檢驗(yàn)：*P=0.471 1＞0.05，在α=0.05水平上失擬差異不顯著，即不存在失擬因素，得到的模型與期望的函數(shù)模型較相符，模型擬合度高[20]。各凝膠化條件的回歸方程一次項(xiàng)的回歸系數(shù)的絕對(duì)值大小之比為X1＞X2＞X3，表明了凝膠化條件對(duì)蛋清蛋白的影響大小及順序?yàn)椋篘aOH用量＞凝膠化溫度＞凝膠化時(shí)間。

另外，而 X1、X2、X12、X22、X32、X2X3在 α=0.01 水平上差異極顯著（**P＜0.01），X3、X1X2、X1X3、在 α=0.05 水平上差異不顯著（P＞0.05），說明三者共同作用時(shí)，凝膠化時(shí)間與凝膠化溫度對(duì)蛋清蛋白凝膠強(qiáng)度的影響大，三者單一作用時(shí)均對(duì)凝膠強(qiáng)度有較為明顯的影響。去除失擬項(xiàng)后得到如下方程（2）：

2.4.3 交互作用分析

響應(yīng)面分析圖直觀地顯示了凝膠化過程中各因素之間的交互作用，考察在某一個(gè)因素固定為中心值不變時(shí)，其他兩個(gè)因素的交互作用對(duì)凝膠強(qiáng)度的影響[21]。根據(jù)回歸方程，作出響應(yīng)面分析圖和等高線圖，部分因素的交互作用如圖4～圖6所示。

響應(yīng)曲面圖可直觀地看出各因素交互作用對(duì)凝膠強(qiáng)度的影響，曲面越陡峭，說明該因素對(duì)其影響越大，交互作用越顯著。等高線形狀為橢圓表示兩因素間的交互作用顯著，圓形等高線表示交互作用不顯著[22-23]。由圖4可以看出凝膠化時(shí)間與NaOH用量之間的交互作用較弱，凝膠化時(shí)間對(duì)凝膠強(qiáng)度的影響略大于NaOH用量；由圖5可知凝膠化溫度與NaOH用量之間的交互作用較為明顯，在固定凝膠化溫度和時(shí)間的條件下，減少NaOH用量有助于提高凝膠強(qiáng)度；最后兩張圖表明凝膠化時(shí)間與凝膠化溫度之間的交互作用顯著，表現(xiàn)為響應(yīng)面曲線較陡峭，等高線較密集且呈現(xiàn)橢圓形。以上結(jié)果均與回歸分析結(jié)果相吻合。

圖4 NaOH用量和凝膠化時(shí)間對(duì)蛋清蛋白凝膠強(qiáng)度的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.4 Response surface and contour plot of alkali dosage and gelation time on egg albumin gel strength

圖5 NaOH用量和凝膠化溫度對(duì)蛋清蛋白凝膠強(qiáng)度的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plot of alkali dosage and gelation temperature on egg albumin gel strength

圖6 凝膠化溫度和凝膠化時(shí)間對(duì)蛋清蛋白凝膠強(qiáng)度的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots of gelatinization gel temperature and gelation time on egg protein gel strength

2.4.4 蛋清蛋白最優(yōu)凝膠化條件的確定與驗(yàn)證

Design Expert8.0軟件對(duì)回歸模型求解后得出的最佳凝膠化條件為：NaOH用量0.8%，凝膠化溫度42℃，凝膠化時(shí)間4 h，最大凝膠強(qiáng)度為0.936 kgf。以此為凝膠化條件，最后進(jìn)行3組平行試驗(yàn)，得出的蛋清蛋白凝膠強(qiáng)度為0.933 kgf，與理論預(yù)測(cè)值0.936 kgf的相對(duì)誤差為1.003%，小于2%，表明二者數(shù)值相近，預(yù)測(cè)值與實(shí)際值較為符合。

3 結(jié)論

NaOH用量、凝膠化溫度和凝膠化時(shí)間對(duì)蛋清蛋白凝膠強(qiáng)度均有不同程度的影響，通過響應(yīng)面法獲得優(yōu)化條件為NaOH用量0.8%，凝膠化溫度42℃，凝膠化時(shí)間4 h，綜合在不同條件下持水力的變化趨勢(shì)，在最優(yōu)凝膠化條件下凝膠強(qiáng)度的預(yù)測(cè)值為0.936 kgf，實(shí)際值為0.933 kgf，二者相近，優(yōu)化結(jié)果可靠。目前就改性對(duì)于蛋清蛋白凝膠性質(zhì)影響的研究尚處于探索階段，暫時(shí)還沒有一種很好的改性方法能夠使蛋清蛋白的凝膠彈性、強(qiáng)度、穩(wěn)定性和透明性等有目的地加以改變，如果在這個(gè)領(lǐng)域能有所突破，那么將可以利用其提高肉制品，方便面制品的營養(yǎng)價(jià)值和對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行改良，所以對(duì)此方面的研究應(yīng)該更深入的進(jìn)行下去，這將會(huì)成為今后蛋清蛋白研究領(lǐng)域的一個(gè)重要的趨勢(shì)，也是食品深加工行業(yè)的一種趨勢(shì)。目前大家對(duì)于蛋清蛋白起泡性、乳化性等方面的研究還不太深入，由于蛋白質(zhì)的各項(xiàng)功能特性之間是相互關(guān)聯(lián)的，因此加強(qiáng)蛋清蛋白凝膠性與其溶解性、乳化性以及起泡性等之間關(guān)系的研究也是有很大的實(shí)用價(jià)值。