熊關(guān)慶，楊玉涔＊，馮 楊，楊世勇*，黃小麗*，汪開毓，苗 懿，劉 釗，段 靖，趙仲孟

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，四川 成都611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，四川 成都611130）

【研究意義】克氏原螯蝦（Pr ocamb arus clar kii）俗稱“小龍蝦”，屬節(jié)肢動物門（Arthropoda）、甲殼綱（Malacostraca）、十足目（Decapoda）、螯蝦科（Cambaridae）、原螯蝦屬（Pr ocamb arus）[1]。原產(chǎn)美國南部和墨西哥北部，我國于20世紀(jì)90年代引進(jìn)并在全國大部分地區(qū)推廣養(yǎng)殖[2]。近年來，克氏原螯蝦在我國養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中迅速發(fā)展，已成為一種特色化、規(guī)模化的特種養(yǎng)殖品種。隨著克氏原螯蝦養(yǎng)殖業(yè)集約化和規(guī)模化的發(fā)展，疾病問題也日益凸顯，嚴(yán)重威脅著該品種的持續(xù)健康發(fā)展。目前已報(bào)道的克氏原螯蝦病原包括：澳洲紅螯螯蝦肝胰腺呼腸孤樣病毒（cherax quadricarinatus hepatopancreatic reo-like virus，CqHRV）、澳洲紅螯螯蝦桿狀病毒（cherax quadricarinatus bacilliform virus，CqBV）、貴族螯蝦桿狀病毒（astacus astacus bacilliform virus，AaBV）、白斑綜合癥病毒（white spot syndrome virus，WSSV）等[3]，其中WSSV的危害尤為突出。【前人研究進(jìn)展】WSSV是一種危害極大的桿狀病毒，該病毒主要感染水生甲殼類動物，包括中國對蝦（P.ch inensis）、墨吉對蝦（P.merguiensis）、長毛對蝦（P.penicil l at us）等在內(nèi)的多種對蝦均可感染[4]。1992年首次在中國臺灣地區(qū)發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖的對蝦感染白斑病毒[5]，到1994年已經(jīng)擴(kuò)展到全亞洲的對蝦養(yǎng)殖地區(qū)，1999年到達(dá)美國中部和南部，2001年歐洲和澳洲地區(qū)也相繼有關(guān)于對蝦感染W(wǎng)SSV的報(bào)道[6]。WSSV不僅易感對蝦，感染途徑亦很簡單，采用投喂和浸泡兩種方式均能感染，并造成其患病死亡[7]。通常對蝦感染W(wǎng)SSV后7～10d死亡率可達(dá)到100%，臨床表現(xiàn)為體表暗紅，發(fā)病初期頭胸甲上出現(xiàn)少量白色斑點(diǎn)[8]，嚴(yán)重時白色斑點(diǎn)連接成片，且腸胃中空[9]。此外，WSSV亦能感染螃蟹和克氏原螯蝦[10]，有相關(guān)研究表明，WSSV在淡水克氏原螯蝦體內(nèi)增殖和感染的特性與對蝦極其相似[11]。近年來，包括浙江[12]、湖北[13]和江蘇[14]等我國大部分地區(qū)相繼出現(xiàn)WSSV感染克氏原螯蝦的報(bào)道，鑒于該病毒的嚴(yán)重危害程度，2009年被農(nóng)業(yè)部《一、二、三類動物疫病病種名錄》列為水生生物一類動物疫病病毒[15]。【擬解決的關(guān)鍵問題】2018年5月，四川某克氏原螯蝦養(yǎng)殖場出現(xiàn)以攝食減少、活力降低、體色變暗為主要癥狀并伴有大規(guī)模死亡的暴發(fā)性疾病，發(fā)病率和死亡率達(dá)50%以上，給養(yǎng)殖戶造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。為了找到該病的發(fā)病原因及病理損害特點(diǎn)，本研究對發(fā)病克氏原螯蝦進(jìn)行臨床癥狀觀察，并通過PCR檢測、系統(tǒng)發(fā)育樹分析，來推測本次患病克氏原螯蝦的病原；同時，結(jié)合組織病理學(xué)技術(shù)檢測各組織病理損傷程度，擬確定該病主要損傷靶器官，并分析致病原因，旨在為WSSV的診斷提供參考借鑒。

1 材料方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 病蝦來自四川某克氏原螯蝦養(yǎng)殖場，送檢時仍存活。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 甲醛溶液，冰乙酸，100%乙醇，二甲苯，瓊脂糖，蘇木精-伊紅染色液，DNA提取試劑盒（成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司）等。

1.2 剖檢觀察及病料采集

將患病克氏原螯蝦冰凍麻醉后剖檢。首先進(jìn)行體表完整性及體表癥狀觀察，接著打開頭胸甲，觀察鰓，肝胰腺等大體病變情況，并迅速采集鰓、心臟、肝胰腺、胃腸道和腹節(jié)肌肉，分別取少量組織用液氮快速凍存后放入-80℃條件下保存，剩余組織放入AFA固定液中保存。

1.3 患病蝦體內(nèi)WSSV的PCR檢測

根據(jù)大體病理觀察推測出患病蝦的病變由感染W(wǎng)SSV引起，通過PCR檢測鑒定，參照何琪瑤[16]等設(shè)計(jì)的引物（表1）利用套氏PCR方法檢測克氏原螯蝦WSSV。將-80℃保存的鰓、心臟、肝胰腺、肌肉組織混合后用液氮快速研磨，研磨至粉末狀后參照DNA提取試劑盒說明書快速提取患病克氏原螯蝦組織DNA，先用外套引物進(jìn)行第一步PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：12.5μL 2×Ta q Master Mix，上、下游引物各1μL，加入模板2μL，8.5μL ddH2O。擴(kuò)增條件：94℃10 min，94℃1 min，55℃30 s，72℃2 min，30個循環(huán)；72℃7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。接著將擴(kuò)增產(chǎn)物10倍稀釋后用內(nèi)套引物進(jìn)行第二步PCR擴(kuò)增，第二步PCR擴(kuò)增產(chǎn)物處理同上一步，PCR產(chǎn)物由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測序，將測序結(jié)果在GenBank上進(jìn)行BLAST比對。

表1 檢測WSSV的引物Tab.1 Detection of primers for WSSV

1.4 WSSV的遺傳進(jìn)化分析

將測序結(jié)果通過NCBI的BLAST查找同源性序列，利用DNAMAN進(jìn)行序列編輯和比對分析，此外，利用MEGA7.0鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.5 患病蝦組織切片制備及病理損傷觀察

將AFA液固定的鰓、心臟、肝胰腺、腸道、腹節(jié)肌肉和眼睛取出，鰓、腹節(jié)肌肉和眼睛用脫鈣液脫鈣5 h，接著水洗過夜，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋、切片（3μm），蘇木精-伊紅（H&E）染色，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理損傷，并拍照記錄。

2 結(jié) 果

2.1 患病蝦的臨床癥狀和解剖特征

患病克氏原螯蝦主要臨床癥狀為體色變暗、攝食減少、活力較差（圖1A）。剖解后發(fā)現(xiàn)，病蝦內(nèi)臟器官大體病變不典型，主要表現(xiàn)為部分腸段中空無食物，腸壁透明，腸管較細(xì)（圖1B-C）；其余器官如肝胰腺、鰓等無明顯變化。

2.2 患病蝦PCR檢測結(jié)果

將-80℃保存的鰓、肝胰腺、腸道和肌肉進(jìn)行混合勻漿，提取混合組織的DNA，用WSSV外引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示，所有樣品均擴(kuò)增出一條1 447 bp的特異性條帶（圖2A）。接著使用WSSV內(nèi)引物對樣品進(jìn)行套氏PCR檢測，所有樣品均擴(kuò)增出一條約940 bp的條帶（圖2B）。套氏PCR產(chǎn)物經(jīng)成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測定后，獲得長度為941 bp的序列。通過BLAST比對，顯示該序列與GenBank中WSSV有100%的同源性，確定本次患病克氏原螯蝦體內(nèi)檢測病毒為WSSV陽性。

圖1 患病蝦臨床特征Fig.1 Clinical characteristics of diseased shrimp

圖2 PCR檢測WSSVFig.2 PCR detection of WSSV

2.3 患病蝦遺傳進(jìn)化分析結(jié)果

將測定序列結(jié)果分別命名為xgq-1、xgq-2和xgq-3，用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3）。結(jié)果顯示，該基因序列與WSSV聚為一簇，與印度株（MH883318.1）、墨西哥株（MG432482.1）和中國株（KX686117.1）等序列同源性為100%，進(jìn)一步確認(rèn)患病克氏原螯蝦體內(nèi)攜帶有WSSV。

2.4 患病蝦組織病理觀察

經(jīng)組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)患病蝦各組織存在如下病變。

肝胰腺：患病克氏原螯蝦肝胰腺組織結(jié)構(gòu)松散，但管腔結(jié)構(gòu)仍然存在，分界較明顯。低倍下可見肝小管管腔擴(kuò)張，星型結(jié)構(gòu)消失，部分肝細(xì)胞壞死、崩解，使肝小管斷裂，殘缺（圖4A）；高倍下可見間質(zhì)有不同程度炎性細(xì)胞浸潤（圖4B），此外還可見部分肝細(xì)胞胞核染色質(zhì)濃縮，胞核崩解、碎裂（圖4C）。表現(xiàn)為中度至重度壞死性肝胰腺炎，

鰓：可見鰓絲及鰓小片血腔嚴(yán)重?cái)U(kuò)張，充盈（圖4D）；鰓絲入鰓動脈和出鰓動脈內(nèi)均可見大量炎性細(xì)胞（圖4E）；高倍下可見柱細(xì)胞極度腫脹，少量壞死（圖4F）。表現(xiàn)為中度充血性鰓炎。

心臟：有大量炎性細(xì)胞浸潤，部分區(qū)域嗜堿性染色增強(qiáng)（圖4G）；高倍下可觀察到大量壞死細(xì)胞及少量嗜酸性粒細(xì)胞（圖4H）。表現(xiàn)為中度壞死性心肌炎。

腸道：可在黏膜下層見到呈團(tuán)分布的炎性細(xì)胞，其余病理變化不典型（圖4I）。腸道表現(xiàn)為輕度腸炎。其他組織器官無明顯組織病理表現(xiàn)。

圖3 WSSV的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of WSSV

圖4 患病蝦組織病理學(xué)表現(xiàn)Fig.4 Histopathological manifestations of diseased shrimp

3 討論與結(jié)論

目前，WSSV檢測方法較多，需篩選一種較為簡捷且準(zhǔn)確度高的方法。套式PCR檢測法[17]是一個檢測WSSV的國家標(biāo)準(zhǔn)，是一種使用兩對PCR引物擴(kuò)增完整的片段的方法，與其他方法更具敏感性高、特異性高等優(yōu)點(diǎn)[18]。李文杰[19]等利用套氏PCR檢測克氏原螯蝦WSSV，結(jié)果顯示該方法檢測極限達(dá)到36 pg，比一步PCR靈敏度提高了1 000倍。本研究采用套氏PCR檢測方法，利用外引物擴(kuò)增出1 450 bp左右的序列，將第一輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物作為內(nèi)引物擴(kuò)增的模板，最終得到一條約940 bp的序列，通過BLAST比對及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析，確定本次患病克氏原螯蝦為WSSV陽性。

組織病理學(xué)診斷法亦是判斷白斑綜合征（white spot disease，WSD）的重要方法，由于WSD組織病理學(xué)研究起步較晚，且主要以研究對蝦為主，目前關(guān)于克氏原螯蝦感染W(wǎng)SD的組織病理學(xué)研究相對缺乏、水平不高，由于病變特征不明，攻擊靶器官不清，阻礙了對該病發(fā)病機(jī)制的深入理解。建立完善的組織病理變化標(biāo)準(zhǔn)，以期為克氏原螯蝦WSSV的鑒定提供參考。本研究中患病克氏原螯蝦表現(xiàn)為明顯的中度至重度壞死性肝胰腺炎、中度充血性鰓炎、以及輕度腸炎，與魏克強(qiáng)[12]及何琪瑤[16]報(bào)道的一致，但未發(fā)現(xiàn)骨骼肌組織病變，卻觀察到患病蝦出現(xiàn)中度壞死性心肌炎。心臟是脊椎動物循環(huán)系統(tǒng)中的動力，是維持機(jī)體正常的代謝和功能的重要器官，一旦出現(xiàn)病變，對機(jī)體危害極大，這可能是造成患病克氏原螯蝦死亡的主要原因。本次觀察到克氏原螯蝦感染W(wǎng)SSV后心臟出現(xiàn)嚴(yán)重的病變，這在之前還未有相關(guān)報(bào)道。因此，最終確定WSSV主要靶器官為肝胰腺、心臟、鰓和腸道，為WSD組織病理學(xué)診斷法提供重要的參考價值。

近年來，克氏原螯蝦需求大增，市場往往供不應(yīng)求，進(jìn)一步刺激了該品種的擴(kuò)張性養(yǎng)殖。因此，對養(yǎng)殖過程中疾病的控制尤為重要。WSSV對水生甲殼類動物危害極大，是克氏原螯蝦養(yǎng)殖過程中的主要威脅。疫苗是病毒病的防治最有效的手段，目前，已研制出多種抗WSSV疫苗，魏克強(qiáng)[20]、Jeroen[21]等制備出抗WSSV的重組VP28蛋白疫苗，并通過實(shí)驗(yàn)證明疫苗對克氏原螯蝦抗病毒有一定的保護(hù)作用；盧亞楠等[22]還制備了WSSV的3種外殼蛋白VP28、VP19、VP15基因疫苗的特異性卵黃抗體，疫苗處理后克氏原螯蝦存活率達(dá)到80%以上。雖然目前研制的疫苗在實(shí)驗(yàn)室范圍內(nèi)體現(xiàn)了良好的抗WSSV保護(hù)作用，但離生產(chǎn)應(yīng)用還有很長的路要走，使用更為方便的口服疫苗將是控制WSD的重要方向。此外，研究發(fā)現(xiàn)WSSV既能橫向傳播，亦可垂直傳播[23]，且只有當(dāng)水環(huán)境中病毒濃度達(dá)到一定程度才能造成感染，大部分發(fā)病區(qū)域是由于水質(zhì)變差給病毒的感染創(chuàng)造了有利的條件。因此，在生產(chǎn)中，應(yīng)該隨時監(jiān)測水質(zhì)情況，一旦惡化及時調(diào)理或換水；此外，蝦苗的繁殖也要重視，大部分養(yǎng)殖戶蝦苗來自于上年塘中剩余親蝦，自產(chǎn)蝦苗需要進(jìn)行抽樣監(jiān)測，如有發(fā)現(xiàn)病毒感染，及時淘汰，從源頭上控制。本研究通過對克氏原螯蝦WSD的診斷及組織病理損傷研究，為生產(chǎn)中WSD的鑒定提供一個較為完整的參考模型。