朱 衡，張繼福，張 云，胡云峰*

（1.中國科學(xué)院 南海海洋研究所/熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點實驗室/廣東省海洋藥物重點實驗室，廣東 廣州510301；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京100049；3.廣東省中醫(yī)院，廣東 廣州510120）

【研究意義】脂肪酶作為重要的工業(yè)用酶，可以催化酯水解、酯交換、酯合成反應(yīng)，在環(huán)境[1]、農(nóng)業(yè)、食品、化妝品、能源[2]、化工合成[3-4]、生物傳感器等行業(yè)均有應(yīng)用[5-6]。Zhang等[7]制備的固定化脂肪酶可以催化生物柴油的制備，為生物能源的產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供了新的方向。隨著對脂肪酶的研究不斷深入，微生物所產(chǎn)脂肪酶受到科研人員長期以來的關(guān)注，并且在諸多工業(yè)領(lǐng)域中有著極其廣泛的應(yīng)用?！厩叭搜芯窟M展】由于固定化載體的連接和保護，酶的天然構(gòu)象可以得到穩(wěn)定，可以抵擋催化環(huán)境酸堿和熱對酶催化劑的攻擊，固定化酶在穩(wěn)定性等方面都會得到提高[8]。相比于游離酶，固定化酶最大的優(yōu)勢是可以重復(fù)利用和易分離，可以極大的降低工業(yè)酶的使用成本，因此固定化成為了脂肪酶等工業(yè)用酶產(chǎn)業(yè)應(yīng)用的關(guān)鍵一步[9]。目前最普遍的吸附固定化方法存在一個很大的缺點，即由于其利用較弱的范德華力和分子間作用力吸附工業(yè)酶，研究者發(fā)現(xiàn)，利用該方法制備的固定化酶在反應(yīng)過程中酶易脫離，造成酶的損失，同時污染了反應(yīng)產(chǎn)物[10]。但是交聯(lián)固定化則利用共價鍵等較強的作用力，可以牢固將酶與載體結(jié)合在一起，從而減少酶脫落的機率[11]。Mehdi等[12]對比了離子結(jié)合、共價結(jié)合與吸附固定化，發(fā)現(xiàn)共價結(jié)合所制備的固定化酶酶活更高?！颈狙芯壳腥朦c】天然材料如甲殼素與殼聚糖，是利用蝦蟹的殼提取和處理得到，兩者具有一系列獨特的特性：生物相容性、對無害產(chǎn)品的生物降解性、無毒性、生理惰性、抗菌性、重金屬離子螯合性、凝膠形成性和親水性，以及對蛋白質(zhì)的顯著親和力[13]，這些特性使得甲殼素和殼聚糖成為固定化的優(yōu)良載體。其中甲殼素是由N-乙酰α-氨基-D-葡萄糖胺以β（1→4）糖苷鍵連結(jié)而成的含氮多糖，經(jīng)過脫酰后得到殼聚糖，但是甲殼素本身仍然含有一定量的氨基[14]。甲殼素相比于殼聚糖的穩(wěn)定性更高，不易溶脹，甲殼素也是目前唯一天然的含有正電荷陽離子基團的可食性動物纖維[15-16]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】脂肪酶等工業(yè)酶在工業(yè)生產(chǎn)中的實際應(yīng)用，仍存在些問題尚未解決，比如酶與底物分離問題和工業(yè)酶的重復(fù)使用性問題等[17-18]。由于人工合成樹脂價格較為昂貴，會增大工業(yè)酶固定化過程的成本。在固定化過程使用殼聚糖或甲殼素，既可以高效利用這些蟹殼廢棄物，又可以為固定化尋找到新的載體。本實驗利用戊二醛的雙醛基團處理甲殼素和殼聚糖，活化表面氨基后與酶的表面氨基反應(yīng)，從而將脂肪酶固定到殼聚糖和甲殼素上，有研究[19]表明戊二醛交聯(lián)是適用于殼聚糖和甲殼素載體制備固定化酶的最佳方法。篩選了市面上的5種甲殼素和9種殼聚糖，得到最佳固定化載體為來自ACMEC公司的甲殼素J3。利用單因素和正交實驗優(yōu)化了制備條件，并進行模擬工業(yè)擴大固定化過程后表明其具備工業(yè)生產(chǎn)的潛力。

1 材料與方法

1.1 材料

固定化材料：5種甲殼素（CAS：1398-61-4）和9種殼聚糖（CAS：9012-76-4），廠商來源見下表1；25%戊二醛：天津福晨化學(xué)試劑。

酶活測定材料：乳化液底物：橄欖油采購于上海麥克林試劑公司；聚乙烯醇采購于天津大茂化學(xué)試劑廠，利用實驗用水配置4%的聚乙烯醇，按照比例聚乙烯醇∶橄欖油=3∶1，進行混合，超聲功率40%，on：2 s，off：1 s，超聲5 min兩次，搖勻，4℃冰箱備用。濃鹽酸購買于廣東白云區(qū)良田光明化工廠；無水乙醇購買于廣東光華科技股份有限公司；異辛烷采購于天津大茂化學(xué)試劑廠；無水醋酸銅、吡啶訂購于上海麥克林試劑公司。

表1 甲殼素及殼聚糖廠商來源Tab.1 Manufacturer sources of chitin and chitosan

1.2方法

1.2.1 酶活測定方法 以乳化橄欖油為底物反應(yīng)15 min，加入無水乙醇和鹽酸終止酶反應(yīng)，使底物乳液破乳，用異辛烷萃取生成的脂肪酸，并用醋酸銅顯色，通過測定銅皂的吸光度來測定生成的脂肪酸的量而得到脂肪酶的活力[20-21]。

1.2.2 固定化優(yōu)化方法（1）單因素實驗。單因素實驗作為后續(xù)條件優(yōu)化的基礎(chǔ)，以酶活為參考標(biāo)準(zhǔn)，針對固定化條件進行了全面的篩選，涉及載體的篩選、交聯(lián)劑濃度、交聯(lián)溫度、交聯(lián)時間、載體量、固定化溫度、pH和固定化時間，各因素下進行3次重復(fù)實驗確定最終結(jié)果。

①載體對固定化效果的影響。從5種甲殼素和9種殼聚糖中篩選最優(yōu)載體，所使用的酶固定化條件為：載體1 g、pH 7.0、戊二醛0.5%、溫度30℃、交聯(lián)2 h、固定化3 h。在40℃，pH 7.0的環(huán)境下測定脂肪酶的酶活。

②固定化順序?qū)潭ɑЧ挠绊?。針對篩選出的最優(yōu)載體J3（ACMEC），嘗試兩種固定化順序：交聯(lián)后固定化和同時固定化，其余酶固定化和反應(yīng)條件同上，進行酶活測定。

③交聯(lián)劑濃度對固定化效果的影響。設(shè)定交聯(lián)劑濃度為0.25%、0.5%、0.75%、1%、1.25%、1.5%，其余條件：J3（ACMEC）載體量1 g、溫度30℃、酶液pH 7.0、交聯(lián)2 h、固定化3 h進行單因素實驗。

④交聯(lián)溫度對固定化效果的影響。設(shè)定交聯(lián)溫度25，30，35，40℃，其余條件：J3（ACMEC）載體量1 g、戊二醛1%、交聯(lián)時間2 h、固定化時間3 h、pH 7.0、固定化溫度30℃進行單因素實驗。

⑤交聯(lián)時間對固定化效果的影響。設(shè)定交聯(lián)時間1，2，3，4，5 h，其余條件：J3（ACMEC）載體量1 g、戊二醛1%、交聯(lián)溫度25℃、固定化時間3 h、pH 7.0、固定化溫度30℃進行單因素實驗。

⑥載體量對固定化效果的影響。設(shè)定0.5，0.75，1，1.25，1.5 g載體量，其余條件：戊二醛1%、交聯(lián)時間2 h、固定化時間3 h、交聯(lián)溫度30℃、pH 7.0、固定化溫度30℃進行單因素實驗。

⑦固定化溫度對固定化效果的影響。設(shè)定固定化溫度25，30，35，40℃。其他條件：1%戊二醛、交聯(lián)溫度30℃、交聯(lián)時間2 h、J3（ACMEC）載體量0.75 g、pH 7.0、固定化時間3 h進行單因素實驗。

⑧pH對固定化效果的影響。設(shè)定pH為5、6、7、8、9，其余條件：1%戊二醛、交聯(lián)溫度30℃、交聯(lián)時間2 h、J3（ACMEC）載體量0.75 g、固定化時間3 h、固定化溫度30℃進行單因素實驗。

⑨固定化時間對固定化效果的影響。設(shè)置固定化時間：1，2，3，4，5 h；其余條件：戊二醛1%、交聯(lián)時間2 h、交聯(lián)溫度30℃、J3（ACMEC）載體量0.75 g、固定化溫度30℃進行單因素實驗。

（2）正交實驗。在單因素基礎(chǔ)上進行正交實驗，針對固定化溫度、固定化時間、pH、載體量進行正交實驗設(shè)計，見下表2。并利用MINITAB 17軟件進行數(shù)據(jù)分析確定最佳條件。

表2 正交實驗設(shè)計Tab.2 Orthogonal experimental design

（3）最佳條件下進行擴大固定化。在最佳條件下進行20倍擴大固定化，以模擬實際工業(yè)級制備固定化酶的過程，從效果來看，擴大固定化酶的酶活并沒有變化，均在170 U/g左右，說明可以進行工業(yè)制備的可能。

1.2.3 酶學(xué)性質(zhì)表征（1）最適反應(yīng)pH。按照最適固定化條件制備的固定化酶與pH 7.0的游離酶，在40℃反應(yīng)溫度下，在pH為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的緩沖液環(huán)境中進行酶活測定，重復(fù)3次并進行比較。

（2）最適反應(yīng)溫度。按照最適固定化條件制備的固定化酶與pH 7.0的游離酶，在以上確定出的最適反應(yīng)pH下，在不同溫度（35，40，45，50，55，60℃）環(huán)境中進行酶活測定，重復(fù)3次并進行比較。

（3）熱穩(wěn)定性。按照最適固定化條件制備的固定化酶與pH 7.0的游離酶，采用不同溫度（40，50，60，70℃）水浴環(huán)境中孵育3 h后，在以上確定出的最適反應(yīng)條件下進行酶活測定；重復(fù)3次并進行比較。

（4）酸堿耐受性。按照最適固定化條件制備的固定化酶：在不同pH（5、6、7、8、9）磷酸緩沖液環(huán)境中浸泡3 h；游離酶：利用不同pH磷酸緩沖液配置酶液，靜置3 h，在以上確定出的最適反應(yīng)條件下進行酶活測定；重復(fù)3次并進行比較。

（5）重復(fù)使用性。按照最適固定化條件制備的固定化酶在相同的底物環(huán)境中重復(fù)進行催化底物水解反應(yīng)，以第一次的酶活為100%，重復(fù)使用6次觀察固定化酶重復(fù)使用性。

（6）儲存穩(wěn)定性。按照最適固定化條件制備的固定化酶分裝成0.1 g/1.5 mL EP管，在4℃環(huán)境中保存一個月，每隔5d測定當(dāng)天的酶活，觀察一個月內(nèi)的酶活變化趨勢。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

由圖1a可知，在實驗條件下，基于編號J3的甲殼素制備的固定化酶的酶活最高，因此后續(xù)選用J3進行單因素實驗。由圖1b可知，先交聯(lián)后固定化獲得的固定化酶的酶活要高于同時交聯(lián)固定化獲得的固定化酶的酶活，同時為了減輕交聯(lián)劑戊二醛對酶的毒害作用，選擇先交聯(lián)后固定化的方法進行脂肪酶的固定化。由圖1c可知，戊二醛的濃度對固定化酶的酶活也有較大的影響，酶活隨著交聯(lián)劑濃度的升高先升后降，在戊二醛的濃度為1%時有最高酶活，因此選取1%的戊二醛濃度進行后續(xù)的單因素實驗。由圖1d可知，在選定的溫度范圍中，固定化酶的酶活隨著溫度升高呈先升后降的趨勢，在30℃時固定化酶的酶活達到最佳酶活，因此選取30℃進行后續(xù)的單因素實驗。由圖1e可知，在選區(qū)的反應(yīng)時間范圍內(nèi)，酶活在反應(yīng)2 h時有最佳酶活，因此選取2 h進行后續(xù)的單因素實驗。由圖1f可知，在選取的載體量范圍內(nèi)，固定化酶酶活在載體量為0.75 g達到最佳酶活，因此后續(xù)選取0.75 g載體量進行后續(xù)的單因素實驗。由圖1g可知，在選取的反應(yīng)溫度范圍內(nèi)，固定化酶在30℃表現(xiàn)出最佳酶活，因此設(shè)定30℃固定化溫度進行后繼的單因素實驗。由圖1h可知，隨著反應(yīng)pH的升高，固定化酶的酶活呈現(xiàn)下降趨勢，因此設(shè)定pH 5.0進行后續(xù)的單因素實驗。由圖1i可知，隨著反應(yīng)時間的延長，固定化酶的酶活呈現(xiàn)先升后降趨勢，選取2 h為最佳固定化時間。

2.2 正交實驗

在單因素實驗基礎(chǔ)上，對固定化條件：pH、固定化時間、載體量、固定化溫度進行正交實驗。在MINITAB 17軟件的幫助下，對正交實驗進行了設(shè)計和分析。重復(fù)3次實驗，所測得結(jié)果見下表3，并利用MINITAB17對結(jié)果進行回歸分析，得到回歸方程為：

y=247.8+6.66A-8.26 B-19.45C-10.85D

表3 正交實驗結(jié)果Tab.3 Results of orthogonal experiment

方差分析見表4，由P（C：載體量）＜0.05，可以判定載體量是對固定化效果影響最為顯著的因素。均值響應(yīng)表數(shù)據(jù)分析見表5，均值效應(yīng)圖見圖2。通過數(shù)據(jù)分析可知影響因素由大到小依次為：載體、溫度、固定化時間和pH；最佳固定化條件為：A2B1C1D1即：pH 5.0、固定化1 h、載體0.5 g、固定化溫度25℃，在此條件下制備的固定化酶酶活達到170 U/g左右。

2.3 擴大固定化

在最佳條件下，進行20倍擴大固定化，在載體為10 g的條件下，所制備的固定化酶相比于未擴大的固定化酶并沒有較大差別的酶活改變，皆為170 U/g左右。因此該方法是具有工業(yè)化制備的潛力。

2.4 酶學(xué)性質(zhì)表征

2.4.1 最適反應(yīng)pH 由圖3a可知，固定化酶的最適反應(yīng)pH為8.0，游離酶最適pH是7.0中性，固定化后在酶和載體間形成的連接鍵導(dǎo)致酶表面的電荷團發(fā)生改變，會引起固定化酶表面的離子狀態(tài)發(fā)生改變，聚集大量陰離子，因此會更偏向于堿性環(huán)境進行催化。

圖1 單因素實驗結(jié)果Fig.1 Results of single-factor experiments

表4 正交試驗結(jié)果方差分析Tab.4 Analysis of variance of orthogonal experiment

圖2 均值相應(yīng)圖Fig.2 corresponding graph of mean value

表5 均值響應(yīng)表Tab.5 Mean response table

2.4.2 最適反應(yīng)溫度 由圖3b可知，固定化酶最適反應(yīng)溫度為40℃，游離酶同樣也是40℃，甲殼素為天然材料，固定化酶保持了天然酶的原有構(gòu)象，因此載體的連接沒有影響到酶的最適反應(yīng)溫度。

2.4.3 酸堿耐受性 由圖3c可知，固定化酶與游離酶的酸堿適應(yīng)性正好相反，游離酶喜好堿性環(huán)境，而固定化酶更喜歡酸性環(huán)境，在pH 9.0時，其殘余酶活僅剩余50%。這和最適反應(yīng)條件不同，因為短時間的反應(yīng)對酶的微環(huán)境影響不大，但是較長時間浸泡則會對固定化酶的結(jié)構(gòu)以及表面離子和電荷的排布造成破壞，因此堿性環(huán)境會對固定化酶的酶活有較為嚴重的影響。

2.4.4 熱穩(wěn)定性 由圖3d可知，固定化酶相比于游離酶的溫度耐受性在更高溫度下才能顯示出來，雖然在50、60℃下降幅度較大，但是60～70℃，酶活下降平緩，維持在50%左右，在70℃下3 h,相比于游離酶僅剩余30%初始酶活，固定化酶J3的殘留酶活更高，這也顯示出該固定化酶的耐熱性還是較好的。連接上載體后，增加了酶的分子量，同時酶分子對于熱的耐受性更加強，可能是因為載體穩(wěn)固了酶的活性構(gòu)象，使其不會較大損傷。

2.4.5 重復(fù)使用性 重復(fù)使用性是衡量固定化酶好壞和是否能夠進行工業(yè)化制備的重要標(biāo)準(zhǔn)，由圖3e可知，該固定化酶J3在重復(fù)使用6次時殘留50%左右的酶活，而游離酶是無法回收重復(fù)使用的。同時，實驗室條件下測定重復(fù)性，固液無法100%分離，在每次使用后會由于碰撞等原因會損失掉一部分固定化酶，因此會導(dǎo)致酶活的降低，因此若在每次使用后再補加適量的固定化酶，相信對于酶活的保持有更為明顯的影響。

2.4.6 保存穩(wěn)定性 由圖3f可知，該固定化酶在4℃下保存30d，其酶活仍有50%，而且在第5天酶活是下降最明顯的，可能因為剛制備完成，固定化酶中會殘余一些水分，水分的存在會影響固定化酶的保存；另外也可能是由于載體上殘余的戊二醛會對脂肪酶的活性有較大的影響，可能需要通過將制備好的固定化脂肪酶在氨基酸等溶液中孵育以去除載體中殘余的戊二醛等有害交聯(lián)劑[22]。

圖3 固定化脂肪酶J3與游離脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)比較Fig.3 Comparison of the enzymatic properties of immobilized LIPASE J3-LIPASE and free lipase

3 結(jié)論與討論

本實驗從14種載體（5種甲殼素，9種殼聚糖）中篩選出最適合海洋脂肪酶固定化的甲殼素載體J3（ACMEC），經(jīng)過單因素和正交實驗確定了其最佳固定化條件：戊二醛1%，交聯(lián)溫度30℃，交聯(lián)時間2 h、pH 5.0、固定化1 h、載體0.5 g、固定化溫度25℃，同時發(fā)現(xiàn)載體量對酶活影響最顯著。將載體量擴大20倍后發(fā)現(xiàn)，該固定化酶J3的酶活達到（170±10）U/g，與未擴大之前并無顯著差別，說明該方法具備工業(yè)應(yīng)用的潛力。該固定化酶在重復(fù)使用性方面的表現(xiàn)最佳，使用6次剩余50%的酶活，羧基載體與EDC交聯(lián)得到的固定化酶，使用6次酶活僅剩余40%，氨基載體LX-1000HA交聯(lián)戊二醛固定化脂肪酶使用6次酶活剩余40%[23]，短鏈氨基載體LX-1000EA交聯(lián)聚乙二醇二縮水甘油醚得到的固定化酶使用6次剩余20%酶活[24]。由此可見：使用同一種海洋假絲酵母脂肪酶進行交聯(lián)固定化，與氨基和羧基合成載體相比，甲殼素作為交聯(lián)固定化的載體，在重復(fù)利用性方面的表現(xiàn)最為優(yōu)異，對于催化過程中酶活的丟失較少，能夠保留較高的初始活性。

甲殼素和殼聚糖作為天然高分子載體材料，其獨有的特點是成本低廉，環(huán)境友好且安全，但是作為生物材料，同樣也凸顯了缺點，特別是殼聚糖載體較容易受到環(huán)境溫度和酸堿變化的影響，影響到固定化酶的催化活性。但是，相比于周蕊等[25]制備的Chitosan-GA固定化酶循環(huán)使用4次僅保留了20%左右的初始酶活力，本研究獲得的固定化酶J3具有較好的連續(xù)使用性；相比于邱玉龍等[26]利用的殼聚糖微球耗時9h進行固定化脂肪酶，本方法更加經(jīng)濟便捷。

該固定化酶在模擬工業(yè)制備實驗中，發(fā)現(xiàn)在最佳制備條件下將載體量擴大20倍，所得固定化酶的酶活并沒有下降，而且固定化后的游離酶液可以回收利用，用于后續(xù)固定化；同時甲殼素載體的成本較低，可以更大程度地降低生產(chǎn)投入，進一步說明該固定化方法具有實際開發(fā)的潛力。