余鈞劍，遲美麗，賈永義，劉士力，竺俊全，顧志敏*

（1.浙江省淡水水產(chǎn)研究所，浙江 湖州313001；2.寧波大學(xué) 海洋學(xué)院，浙江 寧波315211）

【研究意義】翹嘴鲌（Culter albur nus）俗名白魚(yú)，隸屬于鯉科、鲌亞科、鲌屬，其適應(yīng)性較強(qiáng)，廣泛分布于我國(guó)長(zhǎng)江中下游地區(qū)各水域。翹嘴鲌肉白且細(xì)嫩，味美而不腥，一貫被視為上等經(jīng)濟(jì)魚(yú)類，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，是有名的“太湖三白”之一[1-2]。通過(guò)對(duì)遺傳背景一致的全同胞翹嘴鲌苗種同塘養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，性成熟時(shí)雌魚(yú)體質(zhì)量高于雄魚(yú)15%以上，因此養(yǎng)殖全雌翹嘴鲌具有較好的市場(chǎng)前景[3]。雌核發(fā)育技術(shù)可實(shí)現(xiàn)雌性單性化；并且雌核發(fā)育魚(yú)類為母系遺傳，能夠保持母本優(yōu)良性狀，可以大幅度縮短選育周期，高效地實(shí)現(xiàn)選育目標(biāo)，是快速育種繁殖的有效手段[4-7]。翹嘴鲌具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，適應(yīng)于我國(guó)各大淡水養(yǎng)殖環(huán)境，而雌核發(fā)育技術(shù)可快速實(shí)現(xiàn)有利基因純合固定。因此，為了快速而高效地改良翹嘴鲌經(jīng)濟(jì)狀，獲得具有良好養(yǎng)殖性能的翹嘴鲌新品種，開(kāi)展對(duì)雌核發(fā)育翹嘴鲌快速生長(zhǎng)個(gè)體的選育工作，以及從相關(guān)基因?qū)用嫣剿髀N嘴鲌快速生長(zhǎng)機(jī)制具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】抑制素（inhibin，INH）是一種二聚體糖蛋白激素，主要由雄性睪丸支持細(xì)胞和雌性卵巢顆粒細(xì)胞分泌[8]。抑制素由α亞基和不同的β亞基通過(guò)二硫鍵連接而成，其中β亞基有兩種類型（βA和βB）。α亞基和βB亞基構(gòu)成的抑制素稱為抑制素B[9]。抑制素屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factorβ，TGFβ）超家族成員，該超家族的多個(gè)基因均已證明直接或間接與肌肉生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)[10]。而且抑制素在多個(gè)組織內(nèi)均有分布，通過(guò)激素調(diào)控、自分泌和旁分泌的方式來(lái)參與細(xì)胞功能和細(xì)胞增殖[11]。在人類中都發(fā)現(xiàn)抑制素水平與子癇前期胎兒的生長(zhǎng)受限有關(guān)[12]。Vassalli等[13]通過(guò)小鼠的活化素/抑制素βB基因突變的研究表明抑制素βB基因在小鼠胚胎發(fā)育后期起作用，這些研究表明抑制素基因可能參與到機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】繼限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）和簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）后的第3代分子標(biāo)記——單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）是指在基因組上單個(gè)核苷酸的變異[14]，SNP標(biāo)記具有突變位點(diǎn)數(shù)目多、高度的遺傳穩(wěn)定性、有利于實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)[15]。四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR法（tetra-primer amplification refractory mutation system PCR，tetra-primer ARMS PCR）是一種在普通PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)并專門用于檢測(cè)SNP的衍生技術(shù)。該技術(shù)在SNP兩側(cè)分別設(shè)計(jì)兩條內(nèi)引物，內(nèi)引物的3′末端分別與兩種等位基因相匹配，并在SNP兩側(cè)距離不等的適當(dāng)距離設(shè)計(jì)兩個(gè)外引物；根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物特異條帶的長(zhǎng)度大小和有無(wú)，實(shí)現(xiàn)單管PCR對(duì)SNP的分型[16]。Tetra-primer ARMS PCR技術(shù)用于檢測(cè)單核苷酸突變具有快速、簡(jiǎn)便、低成本和可以區(qū)分等位基因是否純合等優(yōu)點(diǎn)[17]。目前，通過(guò)Tetra-primer ARMS PCR，已經(jīng)成功在中華鱉[18]、中國(guó)對(duì)蝦[19]和牛[20]中篩選到與生長(zhǎng)相關(guān)的SNP位點(diǎn)，這些位點(diǎn)已被證明具有用作該生物生長(zhǎng)性狀分子標(biāo)記輔助育種的潛力。作者所在團(tuán)隊(duì)多年來(lái)進(jìn)行雌核發(fā)育翹嘴鲌選育研究，在此研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)雌核發(fā)育一代個(gè)體大小差異明顯，是作為篩選生長(zhǎng)相關(guān)分子標(biāo)記的良好素材。因此，以上研究為以采用四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR對(duì)雌核發(fā)育一代翹嘴鲌抑制素βB基因SNP位點(diǎn)分型提供了條件?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究通過(guò)翹嘴鲌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)抑制素βB基因外顯子序列進(jìn)行擴(kuò)增，利用直接測(cè)序獲得候選SNP位點(diǎn)。然后采用四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR的檢測(cè)方法，對(duì)雌核發(fā)育一代翹嘴鲌抑制素βB基因進(jìn)行SNP位點(diǎn)分型，研究不同SNP分型與其體長(zhǎng)、體質(zhì)量、體厚、體高、全長(zhǎng)、尾柄長(zhǎng)、尾柄高之間的關(guān)聯(lián)分析，探討抑制素βB基因的不同基因型對(duì)生長(zhǎng)的影響情況，通過(guò)這些研究探索雌核發(fā)育翹嘴鲌快速生長(zhǎng)的機(jī)制，獲得特定的輔助選育標(biāo)記，為翹嘴鲌的分子標(biāo)記輔助育種提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 材料

2017年6月通過(guò)對(duì)普通雌性翹嘴鲌的卵與滅活的鯉魚(yú)精子進(jìn)行授精及冷休克處理后獲得的雌核發(fā)育一代翹嘴鲌幼苗，養(yǎng)殖于浙江省淡水水產(chǎn)研究所綜合試驗(yàn)基地同一池塘內(nèi)，保持生長(zhǎng)環(huán)境及飼養(yǎng)條件一致。2018年3月對(duì)同一批次10月齡的雌核發(fā)育一代翹嘴鲌進(jìn)行拉網(wǎng)，從該群體中隨機(jī)取樣144尾。所選個(gè)體分別用電子天平稱取樣品的體質(zhì)量，用游標(biāo)卡尺逐尾測(cè)量體長(zhǎng)、體厚、體高、全長(zhǎng)、尾柄長(zhǎng)、尾柄高等多個(gè)形態(tài)性狀。分別剪取每尾翹嘴鲌的尾鰭置于無(wú)水乙醇中，-20℃凍存?zhèn)溆?，用于提取DNA。

1.2 基因組DNA的提取

使用TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒（TIANGEN），提取雌核發(fā)育一代翹嘴鲌尾鰭中的DNA。使用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果，確定提取DNA的質(zhì)量。用Eppendorf Bio Spectrometer紫外分光光度計(jì)測(cè)定光密度值，確定樣本DNA濃度和純度，于-20℃保存，備用。

1.3 翹嘴鲌抑制素βB基因SNPs位點(diǎn)的篩選

從本課題組已有的翹嘴鲌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的抑制素βB基因mRNA序列，然后與本課題組已有的翹嘴鲌全基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，可知翹嘴鲌抑制素βB基因含有2個(gè)外顯子，采用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)2對(duì)引物：INHBBf1（5′-GGTGCTGTCCACGCTGGTGG-3′）和INHBBr1（5′-CGAAGCTGACTATCTCGTAT-3′）；INHBBf2（5′-CACCAGTCTGTCATTCCAGT-3′）和INHBBr2（5′-ACCCGCAGGACTCGACGATC-3′）。通過(guò)這兩對(duì)引物來(lái)篩選外顯子1和外顯子2上的SNP。從144尾雌核發(fā)育一代翹嘴鲌DNA樣本中選取25個(gè)DNA樣本擴(kuò)增上述兩對(duì)引物。25個(gè)DNA樣本選取標(biāo)準(zhǔn)如下：體質(zhì)量最大的10尾個(gè)體的DNA樣本，依次分成兩組；體質(zhì)量接近平均值的5尾個(gè)體的DNA樣本，分成一組；體質(zhì)量最小的10尾個(gè)體的DNA樣本，依次分成兩組。將每組5尾個(gè)體的DNA樣本相混合，作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系共25μL：上、下游引物各0.5μL，DNA 1μL，2×Taq PCR MasterMix 12.5μL，ddH2O 10.5μL。其中上、下游引物濃度均為10μmol/L，稀釋后的DNA濃度約為50 ng/μL。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min，4℃保存。將擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳30 min，置于Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)Image-lab下觀察，拍照。選取目的條帶清晰明亮且無(wú)雜帶的PCR產(chǎn)物送到上海生工公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用BioEdit軟件進(jìn)行分析，共獲得2個(gè)SNP位點(diǎn)。

1.4 四引物擴(kuò)增受阻突變體系引物設(shè)計(jì)

利用tetra-primer ARMSPCR引物在線設(shè)計(jì)程序進(jìn)行引物設(shè)計(jì)（http：//primer1.soton.ac.uk/primer1.html），產(chǎn)物片段大小控制在150～700 bp。針對(duì)每個(gè)SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)兩條3′末端分別與SNP兩個(gè)等位基因堿基配對(duì)且延伸方向相反的內(nèi)側(cè)引物和2個(gè)外引物，同時(shí)在內(nèi)引物3′端2或3位堿基引入錯(cuò)配以增加擴(kuò)增特異性（表1，錯(cuò)配堿基用斜體字母和下劃線標(biāo)注）。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 翹嘴鲌抑制素βB基因SNP引物序列Tab.1 Sequen of SNP primers on INH B B gene in topmouth culter

1.5 SNP位點(diǎn)的分型與驗(yàn)證

本實(shí)驗(yàn)也對(duì)各個(gè)位點(diǎn)的tetra-primer ARMS PCR反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化。PCR反應(yīng)體系共25μL，主要包括10.1μL ddH2O、1μL 20 ng/μL模板、12.5μL PCR Mix和2μL 10 Mm內(nèi)外引物。引物濃度均為10μmol/L，稀釋后的DNA模板濃度約為50 ng/μL，Mix為2×Taq PCR MasterMix。設(shè)定12個(gè)溫度梯度（依次為54.0，54.3，55.1，56.2，57.2，58.8，60.2，61.5，62.8，63.9，64.7，65.0℃）為退火溫度，探索每組引物的退火溫度，根據(jù)SNP位點(diǎn)分型情況和條帶的清晰程度，以確定最佳的退火溫度。在最適退火溫度下，在25μL反應(yīng)體系中對(duì)內(nèi)、外引物各濃度比例組合在4個(gè)比例水平（4∶1、2∶1、1∶1、1∶2）上進(jìn)行優(yōu)化。以上探索實(shí)驗(yàn)中PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94℃變性30 s，退火30 s（退火溫度Tm，表1），72℃90 s；最后72℃5 min。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳40 min，置于Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)Image-lab下觀察，拍照。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用SNPStats軟件統(tǒng)計(jì)基因型個(gè)體數(shù)、基因型頻率和等位基因頻率等遺傳參數(shù)。采用SPSS 22軟件的獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)和一般線性模型，對(duì)雌核發(fā)育一代翹嘴鲌各個(gè)樣本生長(zhǎng)性狀（體長(zhǎng)、體質(zhì)量、體厚、體高、全長(zhǎng)、尾柄長(zhǎng)、尾柄高）與抑制素βB基因各位點(diǎn)基因型進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 雌核發(fā)育一代翹嘴鲌抑制素βB基因SNPs位點(diǎn)的篩選

對(duì)雌核發(fā)育一代翹嘴鲌抑制素βB基因外顯子1和外顯子2的序列進(jìn)行分段克隆，直接測(cè)序后進(jìn)行峰圖比較篩查SNPs位點(diǎn)。在抑制素βB基因外顯子2序列上獲得2個(gè)SNP位點(diǎn)（圖1和圖2），分別命名為c.717G＞T和c.778G＞A。

圖1 翹嘴鲌抑制素βB基因c.717G＞T位點(diǎn)測(cè)序峰圖Fig.1 The sequencing peak chart of c.717G＞T locus on INHBB gene in topmouth culter

圖2 翹嘴鲌抑制素βB基因c.778G＞A位點(diǎn)測(cè)序峰圖Fig.2 The sequencing peak chart of c.778G＞A locus on INHBB gene in topmouth culter

2.2 雌核發(fā)育一代翹嘴鲌抑制素βB基因的SNP位點(diǎn)ARMS PCR分型結(jié)果

通過(guò)調(diào)整tetra-primer ARMS PCR反應(yīng)條件，最后確定在c.717G＞T位點(diǎn)的tetra-primer ARMS PCR反應(yīng)體系中，退火溫度為61.5℃，內(nèi)、外引物各濃度比例為2：1（即內(nèi)引物上游引物用量、內(nèi)引物下游引物用量、外引物上游引物用量、外引物下游引物用量分別為0.6，0.6，0.3，0.3μL）時(shí)，c.717G＞T的SNP位點(diǎn)獲得良好分型效果。在c.778G＞A位點(diǎn)的tetra-primer ARMS PCR反應(yīng)體系中，退火溫度為58.8℃，內(nèi)、外引物各濃度比例為1∶1（即內(nèi)引物上游引物用量、內(nèi)引物下游引物用量、外引物上游引物用量、外引物下游引物用量分別為0.5，0.5，0.5，0.5μL）時(shí)，c.778G＞A的SNP位點(diǎn)獲得良好分型效果。對(duì)144個(gè)雌核發(fā)育一代翹嘴鲌樣本基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增和分型，結(jié)果如下。

從圖2和3中可以看出，每個(gè)樣品基因組DNA可擴(kuò)增兩條條帶，一條外引物產(chǎn)物和一條內(nèi)引物產(chǎn)物，無(wú)代表雜合型的第3條條帶出現(xiàn)。說(shuō)明雌核發(fā)育一代翹嘴鲌抑制素βB基因c.717G＞T和c.778G＞A位點(diǎn)的基因型均為純合型。由圖3可知，c.717G＞T位點(diǎn)處所有個(gè)體均能擴(kuò)增出511 bp段的外引物產(chǎn)物，GG基因型僅能擴(kuò)增出片段長(zhǎng)度為457 bp的條帶，而TT基因型僅能擴(kuò)增出片段長(zhǎng)度為123 bp的條帶。由圖4可知，c.778G＞A位點(diǎn)處，所有個(gè)體均能擴(kuò)增出511 bp的外引物產(chǎn)物，GG基因型僅能擴(kuò)增出片段長(zhǎng)度為367 bp的條帶，而AA基因型僅能擴(kuò)增出片段長(zhǎng)度為188 bp的條帶。結(jié)果表明ARMS PCR技術(shù)可以用于雌核發(fā)育一代抑制素βB基因c.717G＞T和c.778G＞A位點(diǎn)SNP分型，且結(jié)果與直接測(cè)序所得結(jié)果一致。

圖3 翹嘴鲌抑制素βB基因c.717G＞T位點(diǎn)的凝膠電泳結(jié)果Fig.3 Gel electrophoresis results of c.778G＞A locus on INHBB gene in topmouth culter

圖4 翹嘴鲌抑制素βB基因c.778G＞A位點(diǎn)的凝膠電泳結(jié)果Fig.4 Gel electrophoresis results of c.778G＞A locus on INHBB gene in topmouth culter

2.3 抑制素βB基因c.717G＞T和c.778G＞A位點(diǎn)在雌核發(fā)育一代翹嘴鲌群體中的分布

由表2可知，通過(guò)統(tǒng)計(jì)144個(gè)雌核發(fā)育一代翹嘴鲌的基因型，發(fā)現(xiàn)抑制素βB基因c.717G＞T和c.778G＞A 2個(gè)SNP位點(diǎn)均只有兩種基因型且無(wú)雜合型突變，均為純合型。抑制素βB基因c.717G＞T位點(diǎn)兩種基因型樣本個(gè)體數(shù)目相近，該位點(diǎn)基因型和等位基因頻率也相近。另一方面，抑制素βB基因c.778G＞A位點(diǎn)的GG基因型個(gè)體數(shù)高于AA基因型，GG基因型個(gè)體數(shù)是AA基因型個(gè)體數(shù)的2倍，基因型GG頻率和等位基因G頻率也顯著高于基因型AA頻率和等位基因A頻率。因此，推測(cè)抑制素βB基因c.778G＞A位點(diǎn)的等位基因G為優(yōu)勢(shì)等位基因。

表2 c.717G＞T和c.778G＞A位點(diǎn)的基因型及其等位基因頻率Tab.2 Genotypes and allele gene frequency inc.717G＞T and c.778G＞A locus

2.4 雌核發(fā)育一代翹嘴鲌抑制素βB基因c.717G＞T和c.778G＞A位點(diǎn)與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)性分析

由表3可知，采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，將抑制素βB基因c.717G＞T和c.778G＞A位點(diǎn)單倍型與雌核發(fā)育一代翹嘴鲌中個(gè)體的體長(zhǎng)、體質(zhì)量、體厚、體高、全長(zhǎng)、尾柄長(zhǎng)、尾柄高等7個(gè)性狀進(jìn)行相關(guān)性分析后發(fā)現(xiàn)：抑制素βB基因c.717G＞T位點(diǎn)兩種基因型和c.778G＞A位點(diǎn)兩種基因型與7個(gè)生長(zhǎng)性狀之間都存在顯著差異（P＜0.05）。其中抑制素βB基因c.717G＞T位點(diǎn)GG基因型的個(gè)體的體長(zhǎng)、體質(zhì)量、體厚、體高、全長(zhǎng)、尾柄長(zhǎng)、尾柄高均顯著高于TT基因型的個(gè)體（P＜0.05），GG基因型的個(gè)體的平均體質(zhì)量是TT基因型的個(gè)體的1.7倍。抑制素βB基因c.778G＞A位點(diǎn)GG基因型的個(gè)體的7個(gè)性狀也均顯著高于AA基因型的個(gè)體（P＜0.05），GG基因型的個(gè)體的平均體質(zhì)量是AA基因型的個(gè)體的2.0倍。

表3 翹嘴鲌抑制素βB基因SNP位點(diǎn)不同基因型的生長(zhǎng)性狀指標(biāo)Tab.3 Growth traits of different genotype of SNP locus on IN HBB gene in topmouth culter

c.717G＞T和c.778G＞A位點(diǎn)2種基因型兩兩組合，可得到4種雙倍型，分別為D1（基因型GG&GG，頻率為50.7%）、D2（基因型TT&GG，頻率為18.1%）、D3（基因型TT&AA，頻率為29.2%）、D4（基因型GG&aAA，頻率為2.1%）。除去頻率低于3%的雙倍型組合D4，采用一般線性模型，將3種雙倍型與144尾雌核發(fā)育一代翹嘴鲌中個(gè)體的體長(zhǎng)、體質(zhì)量、體厚、體高、全長(zhǎng)、尾柄長(zhǎng)、尾柄高等7個(gè)性狀進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見(jiàn)表4。分析發(fā)現(xiàn)雙倍型D1（GG&GG）的個(gè)體體長(zhǎng)、體質(zhì)量、體厚、體高、全長(zhǎng)、尾柄長(zhǎng)、尾柄高等7個(gè)性狀與雙倍型D2（TT&GG）個(gè)體之間的差異不顯著（P＞0.05）；而雙倍型D3（TT&AA）個(gè)體的體長(zhǎng)、體質(zhì)量、體厚、體高、全長(zhǎng)、尾柄長(zhǎng)、尾柄高等7個(gè)性狀顯著低于雙倍型D1（GG&GG）和雙倍型D2（TT&GG）個(gè)體（P＜0.05）。

表4 抑制素βB基因不同雙倍型的生長(zhǎng)性狀指標(biāo)Tab.4 Growth traits of different diplotype of SNP locus on I N H B B gene in topmouth culter

3 討 論

SNP是基因組水平上的單核苷酸的變異，具有密度高、遺傳穩(wěn)定性高和代表性強(qiáng)、易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化分析的優(yōu)點(diǎn)，在遺傳多樣性結(jié)構(gòu)分析上具有廣闊的應(yīng)用前景，未來(lái)的SNP的分型檢測(cè)方法將向更高效、更準(zhǔn)確、更靈活的方向發(fā)展[21-23]。SNP是負(fù)責(zé)表型變異或者是選擇的直接靶點(diǎn)，而且在斑節(jié)對(duì)蝦、羅氏沼蝦、太平洋牡蠣等水產(chǎn)動(dòng)物中已被證明某些SNP和經(jīng)濟(jì)性狀關(guān)聯(lián)[24-26]。本研究通過(guò)直接測(cè)序方法對(duì)雌核發(fā)育一代翹嘴鲌抑制素βB基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了2個(gè)SNP位點(diǎn)，并用四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR成功對(duì)c.717G＞T和c.778G＞A這2個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行了分型和驗(yàn)證。分型結(jié)果顯示2個(gè)位點(diǎn)均存在2種基因型，且均為純合子。翹嘴鲌的雌核發(fā)育技術(shù)采用紫外線照射滅活的普通鯉魚(yú)（Cy pr i nus car pio）精子來(lái)刺激普通翹嘴鲌的卵子，利用冷休克法抑制卵子第二極體的釋放，從而促使染色體二倍化[27-28]。由于雌核發(fā)育翹嘴鲌?jiān)谑芫^(guò)程卵母細(xì)胞不分裂出第二極體，卵母細(xì)胞中同一條染色體的兩條姐妹染色單體分離組成雌核發(fā)育翹嘴鲌基因組中的同源染色體，所以雌核發(fā)育翹嘴鲌基因型理論上為純合子，這與本研究結(jié)論一致。

生長(zhǎng)性狀是評(píng)價(jià)水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種有價(jià)值性狀的重要標(biāo)準(zhǔn)之一，主要通過(guò)增加生長(zhǎng)速率，達(dá)到提高經(jīng)濟(jì)效益的目的[29]。本研究以雌核發(fā)育一代的翹嘴鲌為研究對(duì)象，分別將抑制素βB基因c.717G＞T位點(diǎn)2種基因型、c.778G＞A位點(diǎn)2種基因型以及c.717G＞T位點(diǎn)和c.778G＞A位點(diǎn)組成的3種雙倍型與雌核發(fā)育一代翹嘴鲌中個(gè)體的體長(zhǎng)、體質(zhì)量、體厚、體高、全長(zhǎng)、尾柄長(zhǎng)、尾柄高等7個(gè)性狀進(jìn)行相關(guān)性分析。抑制素βB基因c.717G＞T位點(diǎn)GG基因型的個(gè)體與7個(gè)生長(zhǎng)性狀之間的顯著性均顯著高于TT基因型的個(gè)體（P＜0.05）。但是c.717G＞T位點(diǎn)的G→T突變使編碼氨基酸的密碼子CGG變成CGU，該突變?yōu)橥x突變，未導(dǎo)致編碼氨基酸的改變；并且將測(cè)序獲得的抑制素βB基因序列與斑馬魚(yú)該基因序列進(jìn)行序列比對(duì)分析，結(jié)果顯示該位點(diǎn)位于抑制素βB基因開(kāi)放閱讀框內(nèi)。c.717G＞T位點(diǎn)的突變雖未導(dǎo)致氨基酸的改變，但近年來(lái)有研究表明，不同基因密碼子存在使用偏好性，這可能導(dǎo)致mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性或者影響核糖體通過(guò)mRNA的速度受到影響，進(jìn)而直接或者間接影響基因的轉(zhuǎn)錄效率、mRNA翻譯以及蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與活性，來(lái)影響蛋白翻譯[30-31]。調(diào)控核內(nèi)靶基因轉(zhuǎn)錄受到影響后，可能使得在雌核發(fā)育一代翹嘴鲌7個(gè)生長(zhǎng)性狀上，純合GG型個(gè)體顯著高于TT型個(gè)體。抑制素βB基因c.778G＞A位點(diǎn)的G→A突變使編碼丙氨酸的GCC變成編碼蘇氨酸的ACC，為非同義突變；而且該位點(diǎn)也位于基因cDNA的開(kāi)放閱讀框內(nèi)。c.778G＞A位點(diǎn)GG基因型的個(gè)體的7個(gè)性狀均顯著高于AA基因型的個(gè)體（P＜0.05），表明c.778G＞A位點(diǎn)的多態(tài)性對(duì)雌核發(fā)育一代翹嘴鲌生長(zhǎng)性狀也產(chǎn)生影響作用。筆者推測(cè)這是由于基因的單核苷酸突變，使編碼的丙氨酸突變?yōu)樘K氨酸，這種變化可能導(dǎo)致其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生變化，如大口黑鱸組織蛋白B基因C/G轉(zhuǎn)換，以及皮爾蒙特牛和比利時(shí)藍(lán)牛肌肉生長(zhǎng)抑素基因的G/A轉(zhuǎn)換，由于某個(gè)基因突變而導(dǎo)致該生物生長(zhǎng)性狀得到改良[32-33]，可作為高效的分子標(biāo)記應(yīng)用于分子育種。

優(yōu)異基因的聚合能得到理想的累加效應(yīng)，基因聚合最早由Yadav等[34]研究改良芥菜（Bras sica juncea）抗逆和抗病性狀時(shí)提出。目前，基因聚合效應(yīng)已經(jīng)在水產(chǎn)育種方面有報(bào)道。徐磊[35]研究了大黑口鱸（Micro pterus salmoi de）8個(gè)分子標(biāo)記的基因聚合效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)隨著優(yōu)異基因型數(shù)量的增加，平均體質(zhì)量同步遞增?；蛐偷木酆闲?yīng)并不是各基因型效應(yīng)所造成的表型的簡(jiǎn)單相加，而且純合基因型互相組合具有顯著的累加效應(yīng)，能夠穩(wěn)定的遺傳給子代。本研究中c.717G＞T位點(diǎn)GG基因型和c.778G＞A位點(diǎn)GG基因型并不存在交互作用，雙倍型D1（GG&GG）個(gè)體的體長(zhǎng)、體質(zhì)量、體厚、體高、全長(zhǎng)、尾柄長(zhǎng)、尾柄高具有最大均值，但較其它基因型組合差異并不顯著，因而這兩個(gè)優(yōu)異基因型不存在明顯聚合效應(yīng)。然而，雙倍型與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)性型分析顯示，雌核發(fā)育一代翹嘴鲌抑制素βB基因c.778G＞A位點(diǎn)基因型為GG時(shí)，雙倍型D1（GG&GG）和雙倍型D2（TT&GG）的個(gè)體的體長(zhǎng)、體質(zhì)量、體厚、體高、全長(zhǎng)、尾柄長(zhǎng)、尾柄高之間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），c.717G＞T位點(diǎn)堿基突變對(duì)生長(zhǎng)性狀的影響較?。欢鴆.717G＞T位點(diǎn)基因型為TT時(shí)，雙倍型D2（TT&GG）個(gè)體的7個(gè)性狀顯著高于雙倍型D3（TT&AA）個(gè)體，c.778G＞A位點(diǎn)基因型GG個(gè)體的生長(zhǎng)性狀顯著高于基因型AA個(gè)體。因此推斷抑制素βB基因c.717G＞T位點(diǎn)和c.778G＞A位點(diǎn)的突變對(duì)生長(zhǎng)性狀的影響相獨(dú)立和互不干擾，但是c.778G＞A位點(diǎn)為對(duì)生長(zhǎng)性狀的影響更加明顯。

綜上所述，根據(jù)直接測(cè)序方法獲得2個(gè)翹嘴鲌抑制素βB基因SNP位點(diǎn)，設(shè)計(jì)2組引物，分別進(jìn)行四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR，成功鑒別出雌核發(fā)育一代翹嘴鲌抑制素βB基因c.717G＞T位點(diǎn)和c.778G＞A位點(diǎn)的基因型，所得結(jié)果與直接測(cè)序所獲得的突變類型一致。將這兩個(gè)位點(diǎn)基因進(jìn)行分型并與雌核發(fā)育一代翹嘴鲌中個(gè)體的體長(zhǎng)、體質(zhì)量、體厚、體高、全長(zhǎng)、尾柄長(zhǎng)、尾柄高等7個(gè)性狀進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明抑制素βB基因c.717G＞T位點(diǎn)GG基因型和c.778G＞A位點(diǎn)GG基因型的雌核發(fā)育一代翹嘴鲌具有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，而且c.778G＞A位點(diǎn)GG基因型對(duì)雌核發(fā)育一代翹嘴鲌生長(zhǎng)性狀的影響更加明顯。因此，本研究表明采用tetra-primer ARMS PCR技術(shù)用于翹嘴鲌抑制素βB基因c.717G＞T和c.778G＞A位點(diǎn)SNP位點(diǎn)分型是可行的，抑制素βB基因c.717G＞T位點(diǎn)GG基因型和c.778G＞A位點(diǎn)GG基因型均可作為雌核發(fā)育一代翹嘴鲌分子標(biāo)記輔助選育的候選基因。通過(guò)tetra-primer ARMS PCR技術(shù)可快速進(jìn)行翹嘴鲌抑制素βB基因多態(tài)性的鑒別，在實(shí)際生產(chǎn)中可節(jié)省時(shí)間和育種成本，加快翹嘴鲌分子標(biāo)記選育工作進(jìn)程。

致謝：鄭建波博士在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中給予了指導(dǎo)，謹(jǐn)致謝意！