潘 磊，宋麗娟，高 桐，郭 瑞，王紅波，陳禪友

（江漢大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/湖北省食用豆類植物自然科技資源中心/湖北省豆類（蔬菜）植物工程技術(shù)研究中心，湖北武漢430056）

【研究意義】菜豆（Phas eolus vul garis L.）（2 N=2X=22）為豆科菜豆屬的一年生草本植物，是主要的食用豆類蔬菜之一。目前學(xué)術(shù)界認(rèn)為菜豆有兩個(gè)獨(dú)立起源中心，分別是“南墨西哥及中美中心”和“南美洲中心”[1]。菜豆又被稱為四季豆、蕓豆、玉豆等，在世界范圍內(nèi)廣泛種植，而我國(guó)的菜豆栽培面積和產(chǎn)量居于世界前列[2]。據(jù)記載，菜豆在15世紀(jì)傳入中國(guó)，栽培歷史較長(zhǎng)，類型豐富，分布廣，種植面積大。截至2016年3月，經(jīng)過(guò)中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院編目入庫(kù)的菜豆（粒用類型為主）約有5 677份[3]。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，依據(jù)生長(zhǎng)習(xí)性，可將菜豆劃分為直立型和蔓生型[4]；依據(jù)用途，又可分為粒用菜豆和莢用菜豆。隨著市場(chǎng)需求的變化，培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)抗性好的菜豆品種，一直是菜豆育種的主攻方向。對(duì)不同種質(zhì)資源的遺傳背景進(jìn)行分析，區(qū)分種質(zhì)間的差異，鑒定親緣關(guān)系，遺傳多樣性評(píng)價(jià)等，對(duì)于育種具有重要意義。因此，利用分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行輔助育種成為當(dāng)前育種的研究焦點(diǎn)之一。【前人研究進(jìn)展】插人/缺失（InDel，insertion/deletion）標(biāo)記是指在近緣種或者同一個(gè)物種不同個(gè)體之間的基因組同一位點(diǎn)的序列發(fā)生的不同大小核苷酸片段的插入或缺失，是同源序列比對(duì)產(chǎn)生的空位現(xiàn)象[5-6]。InDel在基因組上數(shù)量多，分布廣。InDel分子標(biāo)記本質(zhì)上仍然屬于DNA序列長(zhǎng)度多態(tài)性的標(biāo)記。InDel標(biāo)記作為一種共顯性的分子標(biāo)記，準(zhǔn)確性高、穩(wěn)定性好，而且以PCR擴(kuò)增技術(shù)為基礎(chǔ)，檢測(cè)方便，經(jīng)濟(jì)有效。目前，InDel標(biāo)記已經(jīng)廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物的分子基礎(chǔ)研究中，進(jìn)行基因型鑒定、遺傳多樣性分析、基因定位以及功能標(biāo)記開發(fā)等。楊雙娟等[7]采用甘藍(lán)InDel標(biāo)記進(jìn)行種子純度鑒定分析。魏利斌等[8]利用InDel分子標(biāo)記進(jìn)行芝麻遺傳多樣性分析，可將國(guó)內(nèi)和國(guó)外芝麻資源劃分為兩大類，且絕大多數(shù)芝麻材料的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。利用番茄粉紅色果實(shí)相關(guān)基因的InDel標(biāo)記，能有效區(qū)分紅色、粉紅色和雜合基因型，可以用于番茄苗期分子標(biāo)記輔助選擇[9]。在水稻中，采用InDel標(biāo)記能判別水稻的秈粳屬性，鑒別不同品種類型[10-12]?；?9個(gè)多態(tài)性InDel標(biāo)記，構(gòu)建了42個(gè)綠豆主栽品種的DNA指紋圖譜，能鑒定綠豆品種真?zhèn)蝃13]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】然而，在菜豆的InDel分子標(biāo)記研究與應(yīng)用方面，目前知之甚少，在為數(shù)不多的研究報(bào)道中，Moghaddam等[14]基于二代測(cè)序技術(shù)在菜豆中開發(fā)了2 687InDel分子標(biāo)記，并對(duì)24個(gè)國(guó)外菜豆品種進(jìn)行檢測(cè)，篩選獲得了172個(gè)多態(tài)性InDel標(biāo)記?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究嘗試將InDel標(biāo)記應(yīng)用于我國(guó)菜豆種質(zhì)資源，分析其遺傳多樣性和遺傳關(guān)系，從而為菜豆遺傳資源的保護(hù)和遺傳改良等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究中供試的25份菜豆種質(zhì)材料，均由湖北省食用豆類植物自然科技資源中心和湖北省豆類（蔬菜）植物工程技術(shù)中心提供（表1）。

表1 供試25份菜豆種質(zhì)資源信息列表Tab.1 Information of 25 common bean accessions used in this study

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菜豆基因組總DNA的提取純化及檢測(cè) 使用植物DNA提取試劑盒（北京天根生物科技有限公司），提取菜豆基因組總DNA，具體步驟方法參見試劑盒說(shuō)明書。用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)進(jìn)行DNA檢測(cè)。采用mySPEC超微量分光光度計(jì)（mySPEC，奧地利）測(cè)定DNA質(zhì)量和濃度。

1.2.2 引物的設(shè)計(jì)和PCR的擴(kuò)增 菜豆InDel分子標(biāo)記引物序列參考Moghaddam等[14]，引物序列見表2，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.3 PCR擴(kuò)增體系 采用25μL反應(yīng)體系，其中2.5μL 10×buffer（含Mg2+），2.5μL dNTP（2.5 mmol/L），0.3μL Taq酶（5 U/μL），正向和反向引物各1μL（10μmol/L），DNA模板（50 ng/μL）1μL，ddH2O補(bǔ)足25μL。

在Nexus gradient梯度PCR儀（Eppendorf，德國(guó)）上進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃，預(yù)變性3 min；35個(gè)循環(huán)（95℃，40 s，最適退火溫度，40 s，72℃，40s）；72℃延伸10 min。4℃保存?zhèn)溆谩Ｓ?0 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物，用自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照記錄。對(duì)于沒(méi)有出現(xiàn)電泳條帶的DNA樣本重復(fù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。若重復(fù)3次仍無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物，則認(rèn)為擴(kuò)增引物無(wú)效。

1.3 數(shù)據(jù)分析

1.3.1 菜豆籽粒農(nóng)藝性狀評(píng)價(jià)方法 對(duì)25個(gè)不同的菜豆種質(zhì)，每個(gè)材料每次取50粒，重復(fù)3次，觀測(cè)記錄籽粒相關(guān)的農(nóng)藝性狀指標(biāo)。用游標(biāo)卡尺測(cè)量籽粒長(zhǎng)度、籽粒寬度、籽粒厚度，觀察種皮顏色，用天平稱量50粒質(zhì)量，再換算成百粒質(zhì)量。

表2 菜豆中12個(gè)多態(tài)性InDel分子標(biāo)記Tab.2 Twelve polymorphic InDel molecular markers in common bean

1.3.2 InDel分子標(biāo)記評(píng)價(jià)方法 將擴(kuò)增產(chǎn)物的帶型錄入Excel，采用PopGen32[15]軟件計(jì)算遺傳參數(shù)分析，包括期望雜合度（He，expected heterozygosity）、觀察雜合度（Ho，observed heterozygosity）、引物多態(tài)性信息含量（PI C，polymorphism information content）、有效等位基因數(shù)（Ne，effective number of alleles per loci）和遺傳多樣性指數(shù)（I，Shannon’s Information index）。構(gòu)建25個(gè)菜豆種質(zhì)的0，1矩陣，采用NTSYS-pc 2.11軟件[16]進(jìn)行UPGMA聚類分析。

2 結(jié) 果

2.1 菜豆種子表型變異

供試25份菜豆種子表型變異比較結(jié)果（表3），單粒長(zhǎng)度變異區(qū)間均在0.19 cm（SJ0182）～0.34 cm（-）（SJ0156），單粒寬度變異區(qū)間在0.12 cm（SJ0225）～0.20 cm（SJ0193），單粒厚度變異區(qū)間在0.10 cm（SJ0181）～0.19 cm（SJ0193），百粒質(zhì)量變異區(qū)間在19.06 g（SJ0187）～53.00 g（SJ0179）。種皮的顏色大致可劃分為純色和花色兩個(gè)系列。純色主要包括為黃色（7份）、黑色（5份）、白色（4份）和紅色（1份）；而種皮花色的類型包括紅色帶黃斑（4份）、黃色帶紅斑（2份）、紅色帶白斑（1份）和黃色帶白斑（1份）。

表3 25份菜豆籽粒統(tǒng)計(jì)分析Tab.3 Statistic analysis of seeds variation of 25 common bean accessions used in this study

圖1 25份菜豆種子表型Fig.2 Seeds of 25 common bean accessions in this study.Cluster of 25 common bean accessions based on UPGMA.

2.2 菜豆InDel標(biāo)記多態(tài)性分析

利用12對(duì)InDel多態(tài)性引物對(duì)25份菜豆種質(zhì)資源進(jìn)行了檢測(cè)（圖2），共探測(cè)到26個(gè)InDel位點(diǎn)（表4），平均位點(diǎn)數(shù)是2.17個(gè)。引物的平均有效等位位點(diǎn)數(shù)為1.78個(gè)，多態(tài)信息含量P IC平均值是0.33，期望雜合度（He）平均值為0.42，觀察雜合度（Ho）平均值為0.52，群體的遺傳多樣性指數(shù)I為0.63。

圖2 InDel引物NDSU_IND_09_00.4358的多態(tài)性電泳Fig.2 Polymorphism of the amplification products using InDel primer NDSU_IND_09_00.4358

表4 12個(gè)InDel標(biāo)記在25份菜豆種質(zhì)中的多態(tài)性信息Tab.4 Genetic variation of twelve polymorphic InDel markers in 25 common bean accessions

2.3 菜豆種質(zhì)資源的聚類分析

為探尋供試菜豆資源之間的遺傳關(guān)系，對(duì)25份菜豆種質(zhì)資源進(jìn)行UPGMA聚類分析（圖3）。聚類結(jié)果表明，遺傳相似性系數(shù)在0.5～0.95，相似系數(shù)為0.54時(shí)，供試的菜豆材料可分為5類。

第I類7份材料（SJ0156、SJ0185、SJ0160、SJ0227、SJ0201、SJ0203和SJ0243），第II類5份材料（SJ0180、SJ0209、SJ0181、SJ0182和SJ0215），第III類5份材料（SJ0179、SJ0225、SJ0192、SJ0193和SJ0222），第IV類4份材料（SJ0162、SJ0202、SJ0226和SJ0245），第V類4份材料（SJ0187、SJ0232、SJ0229和SJ0234）。

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，聚類結(jié)果與其種皮顏色存在一定相關(guān)性。第I類的7份材料中大多數(shù)純色類型，其中黃色3份（SJ0227、SJ0201、SJ0243、SJ0185）、黑色2份（SJ0160、SJ0203）、紅色1份（SJ0156）；第II類5份材料中以純色類型為主，籽粒多為白色，其中白色3份（SJ0180、SJ0181、SJ0215），黑色1份（SJ0182），SJ0209的種皮雖然是花色，但也存在白色斑點(diǎn)區(qū)域；第III類5份材料的籽粒以花色類型為主，共有4份花色材料（SJ0179、SJ0225、SJ0192、SJ0193），種皮具有紅斑、黃斑或者白斑；第IV類4份材料的籽粒以花色類型為主，大多與黃色相關(guān)，其中3份材料的種皮為全黃色（SJ0162）或部分黃色（SJ0202、SJ0226）；第V類的4份材料的籽粒都為純色，多為黃色類型（SJ0232、SJ0229、SJ0234），另有一份黑色類型（SJ0187）。綜上，純色系列包括第I、II、V類（黃色、黑色、白色、紅色），花色系列包括第III、IV類（黃色帶紅斑、紅色帶黃斑、紅色帶白斑）。這種色系的遺傳差異可能是由于在進(jìn)化過(guò)程中受到人工選擇的影響而造成的。

此外，在遺傳相似系數(shù)為0.95時(shí)，有兩份菜豆材料雖然種皮顏色不同（SJ0180為白色和SJ0209為黃色帶白斑），但是本研究中的InDel標(biāo)記無(wú)法區(qū)分兩者，可能是由于兩者的親緣關(guān)系較近，InDel標(biāo)記數(shù)量不夠而造成的。

圖3 25份菜豆種質(zhì)資源的UPGMA聚類分析Fig.3 Cluster of 25 common bean accessions based on UPGMA

3 討論

InDel標(biāo)記是一種共顯性分子標(biāo)記，在基因組上分布廣泛，密度大，適宜于進(jìn)行全基因組分子標(biāo)記的發(fā)掘[17]。當(dāng)前隨著高通量測(cè)序技術(shù)的不斷進(jìn)步，InDel標(biāo)記開發(fā)成本逐漸降低[18]。InDel標(biāo)記的實(shí)質(zhì)是一種DNA片段長(zhǎng)度多態(tài)性遺傳標(biāo)記，能利用PCR擴(kuò)增進(jìn)行基因型分型，檢測(cè)技術(shù)快捷經(jīng)濟(jì)，可在電泳平臺(tái)上進(jìn)行。因此，InDel標(biāo)記是近年來(lái)一種較為熱門的DNA分子標(biāo)記技術(shù)，廣泛應(yīng)用于種質(zhì)資源分析、分子輔助遺傳育種、群體遺傳分析、圖位克隆、基因定位及遺傳圖譜的構(gòu)建等研究[12][19]。在農(nóng)作物研究領(lǐng)域，InDel分子標(biāo)記技術(shù)已在水稻[20]、玉米[21]、油菜[22]、黃瓜[23]等作物研究中進(jìn)行了報(bào)道。但是，在菜豆中的In-Del研究還十分有限，尤其是針對(duì)菜豆種子遺傳變異的InDel標(biāo)記研究尚未見報(bào)道。

然而，評(píng)價(jià)菜豆種子的遺傳多樣性，揭示個(gè)體間的遺傳背景差異和親緣關(guān)系，對(duì)于菜豆育種而言是十分重要而且必要的。因此，本研究引入InDel標(biāo)記技術(shù)，用于分析我國(guó)菜豆種子的遺傳變異特點(diǎn)。通過(guò)多個(gè)遺傳多樣性參數(shù)（觀測(cè)雜合度、期望雜合度、有效等位數(shù)、引物多態(tài)信息含量等）分析，反映出供試菜豆種質(zhì)資源具有中等水平的遺傳多樣性。其中，P IC值是評(píng)判基因片段多態(tài)性的重要參數(shù)之一。12對(duì)InDel引物的平均P IC＞0.3，多態(tài)性程度較高，能有效區(qū)分基因型之間的差異，其中兩個(gè)InDel引物（NDSU_IND_09_00.4358和NDSU_IND_01_05.0609）的PI C＞0.5，將有利于應(yīng)用在菜豆的遺傳多樣性分析和遺傳圖譜構(gòu)建等研究中。為研究不同菜豆材料之間的遺傳關(guān)系，基于12對(duì)InDel多態(tài)性引物對(duì)25分菜豆種質(zhì)材料的結(jié)果，進(jìn)行UPGMA聚類分析，可將其分為5類。聚類結(jié)果表明供試種質(zhì)的地區(qū)間分類界限不明顯，但是絕大多數(shù)材料的聚類與種皮顏色有關(guān)，可大致區(qū)分純色和花色的種皮，推測(cè)這種種皮顏色的遺傳差異，可能是受到人工選擇的影響。此外，有兩個(gè)菜豆材料無(wú)法區(qū)分開來(lái)，可能需要更多的多態(tài)性InDel分子標(biāo)記。

綜上，本研究將12對(duì)菜豆InDel多態(tài)性引物成功應(yīng)用于25份菜豆材料的分子標(biāo)記研究。研究結(jié)果不僅揭示了供試菜豆種質(zhì)的中等遺傳多樣性水平，也反映出了不同種質(zhì)之間的遺傳關(guān)系，還能用于品種DNA指紋圖譜的構(gòu)建。因此，本研究將為菜豆遺傳資源的評(píng)價(jià)、鑒定和保護(hù)利用等提供分子依據(jù)。