劉星月，朱強(qiáng)龍，單 楠，孫靜宇，張宏玉，李慧英，黃英金，方加軍，周慶紅*

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)應(yīng)對(duì)氣候變化南昌市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌330045；2.江西省江天農(nóng)業(yè)科技有限公司，江西上饒334001）

【研究意義】在對(duì)多子芋品種江芋2號(hào)脫毒快繁培養(yǎng)過(guò)程中，篩選到側(cè)球莖不膨大的體細(xì)胞無(wú)性系變異材料（命名為江芋4號(hào)），其變異性狀在后代繁育和田間多代種植中能夠穩(wěn)定遺傳，研究該突變材料與其親本間的性狀差異和遺傳變異，對(duì)明確變異材料的育種潛力和生產(chǎn)利用價(jià)值具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】植物離體培養(yǎng)過(guò)程中，由于外植體本身或在外界培養(yǎng)條件的刺激下，其再生植株體細(xì)胞容易發(fā)生染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)的變異，優(yōu)良的變異是作物種質(zhì)創(chuàng)新和新品種選育的重要途徑[1]。分析體細(xì)胞突變除依據(jù)外部形態(tài)特征（如植株形態(tài)、生長(zhǎng)習(xí)性、抗性）考察外，早期主要采用同工酶酶譜[2]及染色體觀察[3]進(jìn)行無(wú)性系變異的鑒定[4]。近年來(lái)，SSR、SRAP和ISSR等分子標(biāo)記技術(shù)被廣泛用于植物體細(xì)胞無(wú)性系變異間基因水平的差異，如尹明華[5]等通過(guò)RAPD分子標(biāo)記和流式細(xì)胞術(shù)來(lái)分析和檢測(cè)了江西鉛山紅芽芋再生苗的遺傳穩(wěn)定性，結(jié)果表明愈傷組織再生苗具有較大的遺傳變異；鄒雪等[6]采用SCOT和RAPD兩種分子標(biāo)記鑒定了耐低磷和鹽脅迫突變體與母本間的遺傳差異。聶瓊和文曉鵬[7]采用ISSR、SRAP和IRAP標(biāo)記技術(shù)對(duì)火龍果不同快繁代數(shù)的再生幼苗進(jìn)行遺傳變異分析，發(fā)現(xiàn)隨著繁殖代數(shù)多，體細(xì)胞無(wú)性系變異頻率越高，不同分子標(biāo)記能夠有效檢測(cè)基因組不同區(qū)域的DNA變異?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】芋（Colocasia es cul enta L.Schott）是天南星科（Araceae）芋屬能形成地下球莖的栽培種，在溫帶和亞熱帶地區(qū)普遍栽培，是世界第5大根莖類(lèi)作物和第14大蔬菜作物[8]。其地下球莖富含淀粉、蛋白質(zhì)及非淀粉性多糖等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和功能成分，是芋主要食用器官。多子芋是球莖用芋的三大類(lèi)型（魁芋、多子芋和多頭芋）之一[9]，也是我國(guó)長(zhǎng)江流域栽培最為廣泛的芋類(lèi)型，其主球莖（主莖地下部分膨大形成，俗稱(chēng)母芋）不發(fā)達(dá)，側(cè)球莖（主球莖上腋芽膨大發(fā)育而成，俗稱(chēng)子芋）多而群生，為多子芋主要產(chǎn)品器官。課題組前期在對(duì)多子芋品種江芋2號(hào)莖尖脫毒培養(yǎng)和繼代增殖培養(yǎng)的過(guò)程中，篩選到了穩(wěn)定的側(cè)球莖不膨大變異材料，將其分別命名為江芋4號(hào)，這為研究多子芋側(cè)球莖膨大發(fā)育提供了獨(dú)特材料，也為多子芋新品種選育提供了優(yōu)異材料，有必要對(duì)其主要農(nóng)藝性狀及遺傳差異進(jìn)行深入研究?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究基于前期研究篩選出的多子芋體細(xì)胞無(wú)性系變異材料，對(duì)變異材料表型、產(chǎn)量和品質(zhì)相關(guān)性狀進(jìn)行考察和測(cè)定，采用SSR分子標(biāo)記分析變異材料與親本的遺傳差異，為進(jìn)一步利用其開(kāi)展芋種質(zhì)創(chuàng)新和新品種選育提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

多子芋品種江芋2號(hào)及其組培變異材料江芋4號(hào)種芋由江西省紅芽芋工程技術(shù)中心提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及性狀鑒定

試驗(yàn)設(shè)兩種處理，一是將江芋2號(hào)和江芋4號(hào)于2019年4月初播種于套桶中栽培，每桶種植1株，栽培基質(zhì)為有機(jī)營(yíng)養(yǎng)土，每份材料種植10株，3次重復(fù)。在其植株側(cè)球莖膨大初期至成熟期期間，每7d對(duì)膨大期側(cè)球莖的橫徑、縱徑進(jìn)行測(cè)定，共統(tǒng)計(jì)7次（A～G 7個(gè)時(shí)期）。二是將江芋2號(hào)和江芋4號(hào)材料分別種植于江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)試驗(yàn)基地，每試驗(yàn)材料種植1個(gè)小區(qū)，小區(qū)面積為20.16 m2，株行距為30 cm×70 cm，每小區(qū)種植96株，3次重復(fù)，常規(guī)管理。于2019年9月21日對(duì)所有材料進(jìn)行單株產(chǎn)量測(cè)定，測(cè)定性狀包括：母芋質(zhì)量/g、子芋個(gè)數(shù)/個(gè)、子芋質(zhì)量/g、孫芋個(gè)數(shù)/個(gè)、孫芋質(zhì)量/g、單株總質(zhì)量/g、地上部鮮質(zhì)量/g等[10]。此外，對(duì)親本及突變體側(cè)球莖（子芋）進(jìn)行品質(zhì)分析，其可溶性糖總糖含量采用苯酚-硫酸法測(cè)定，還原性糖含量采用3，5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定，淀粉含量采用碘比色法測(cè)定，纖維素含量采用蒽酮比色法測(cè)定，VC含量采用鉬藍(lán)比色法測(cè)定，蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定。具體參考高俊鳳的《植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》[11]。

1.3 染色體數(shù)目及倍性測(cè)定

于10：00左右取旺盛生長(zhǎng)中的江芋2號(hào)和江芋4號(hào)5 mm左右長(zhǎng)的植株根尖，采用常規(guī)壓片法[12]進(jìn)行染色體壓片，置顯微鏡下觀察根尖細(xì)胞的染色體形態(tài)和數(shù)目；此外，以普通二倍體西瓜基因組作參考，采用流式細(xì)胞術(shù)[13]對(duì)江芋2號(hào)和江芋4號(hào)進(jìn)行倍性水平和DNA含量進(jìn)行了測(cè)定。

1.4 SSR分子標(biāo)記鑒定

參照Lu等[14]和Hu等[15]文獻(xiàn)，通過(guò)上海生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成38對(duì)SSR引物，用于江芋2號(hào)、江芋4號(hào)及其他118份芋資源的遺傳差異分析。采用改良CTAB法[16]提取所有材料幼嫩葉片基因組DNA，經(jīng)瓊脂糖檢測(cè)合格后存于-20℃冰箱中備用。

SSR-PCR反應(yīng)體系（10μL）：5μL 2×TSingKe Master mix，1μL DNA，0.5μL上游引物，0.5μL下游引物，3μL dd H2O；在T100TMThermal Cycler PCR儀上擴(kuò)增：95℃5 min；95℃30 s，60℃30 s，72℃30 s，40個(gè)循環(huán)；72℃5 min，4℃。取2μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入0.5μL Loading Buffer，于DYY-6C型電泳儀進(jìn)行8%聚丙烯酰胺凝膠電泳（220 V，3 h），硝酸銀染色，BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)中拍照記錄。

僅讀取100～800 bp清晰易于識(shí)別的條帶，有帶記為“1”，無(wú)帶記為“0”，運(yùn)用NT-SYS pc2.10e軟件[17]對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，按照非加權(quán)成對(duì)算術(shù)平均法（UPGMA）以相似系數(shù)對(duì)參試材料進(jìn)行聚類(lèi)分析。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel和SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和方差分析。

2 結(jié)果分析

2.1 變異株表型及產(chǎn)量相關(guān)性狀分析

從圖1可以看出，江芋2號(hào)與其突變株江芋4號(hào)表型性狀存在一定的差異，變異株相對(duì)于親本表型差異主要表現(xiàn)為地下側(cè)球莖（子、孫芋）芋形突變?yōu)殚L(zhǎng)棒狀，莖節(jié)間距明顯變長(zhǎng)，其生長(zhǎng)方向也變?yōu)闄M向生長(zhǎng)，子芋幾乎不膨大（B1，B2，D1，D2）。此外，突變株相比親本地上部植株更高大，葉柄更細(xì)長(zhǎng)，葉片數(shù)也較多（B1，B2，C1，C2）。將突變株的長(zhǎng)棒狀子芋做種芋進(jìn)行種植，其幼苗表現(xiàn)出較快的生長(zhǎng)速度（A1，A2）。從表1可以看出，江芋4號(hào)子芋芋型指數(shù)（5.68）與野生型江芋2號(hào)（1.41）存在顯著差異；從子芋平均單質(zhì)量看，江芋4號(hào)子芋平均單質(zhì)量（20.4 g）與江芋2號(hào)（55.2 g）也存在顯著性差異。

表1 多子芋不同組培變異材料子芋芋型指數(shù)與單質(zhì)量比較Tab.1 Comparison of shape index and average quality of different variants of son taros

圖1 江芋2號(hào)與江芋4號(hào)植株表型性狀比較Fig.1 Comparison of plant phenotypic characters of Jiangyu 2 and Jiangyu 4

從圖2可以看出，兩份材料側(cè)球莖的縱徑在整個(gè)調(diào)查過(guò)程中都表現(xiàn)出持續(xù)上升的趨勢(shì)，變異株江芋4號(hào)的縱徑由0.51 cm（A期）上升到9.89cm（G期），增長(zhǎng)值顯著高于江芋2號(hào)（A期0.28 cm～G期5.41 cm）；江芋2號(hào)側(cè)球莖的橫徑生長(zhǎng)速度（A期0.49 cm～G期2.66 cm）稍慢于縱徑，但呈持續(xù)上升的趨勢(shì)，而江芋4號(hào)的橫徑在第3個(gè)時(shí)期（C期1.35 cm）之后的幾乎停止膨大，與其縱徑生長(zhǎng)呈現(xiàn)出顯著不同。

圖2 江芋2號(hào)和江芋4號(hào)不同發(fā)育時(shí)期子芋橫縱徑比較Fig.2 Comparison of width and length of first grade cormels between Jiangyu 2 and Jiangyu 4

從表2可以看出，突變株江芋4號(hào)地上部植株高大，與野生型江芋2號(hào)地上部鮮質(zhì)量存在顯著差異，是其3.21倍，但江芋4號(hào)子芋個(gè)數(shù)較少（平均每株約3～4個(gè)），孫芋未見(jiàn)形成，而親本江芋2號(hào)子、孫芋總數(shù)超過(guò)20個(gè)，其子、孫芋總質(zhì)量及地下部球莖總質(zhì)量均顯著高于江芋4號(hào)；此外，江芋4號(hào)全株鮮質(zhì)量高于江芋2號(hào)，但差異不顯著。

表2 江芋2號(hào)與江芋2號(hào)產(chǎn)量相關(guān)性狀比較Tab.2 Comparison of yield-related traits between Jiangyu 2 and Jiangyu 4

2.2 變異株側(cè)球莖營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)分析

側(cè)球莖（子、孫芋）營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)測(cè)定分析（表3）表明，組培變異株江芋4號(hào)與親本江芋2號(hào)除可溶性總糖含量差異不顯著，其他營(yíng)養(yǎng)成分均存在顯著差異。江芋2號(hào)可溶性總糖和還原性糖含量均高于江芋4號(hào)；江芋4號(hào)淀粉、纖維素含量、可溶性蛋白含量及Vc含量含量均顯著高于親本江芋2號(hào)。

表3 江芋2號(hào)和江芋4號(hào)子芋營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)比較Tab.3 Comparison of nutrient quality characters of taro between Jiangxi 2 and Jiangyu 4

圖3 江芋2號(hào)野生型和江芋4號(hào)突變體染色體數(shù)目和倍性檢測(cè)Fig.3 Detection of chromosome number and ploidy of Jiangyu 2 and Jiangyu 4

2.3 變異株及親本染色體數(shù)目及倍性檢測(cè)分析

從圖3可以看出，采用常規(guī)壓片法可以獲得江芋2號(hào)和江芋4號(hào)的分散良好、形態(tài)清晰的有絲分裂中期染色體，通過(guò)染色體計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)江芋2號(hào)和江芋4號(hào)染色體數(shù)目均為42條，變異株在染色體數(shù)目上與親本江芋2號(hào)一致。此外，以普通二倍體西瓜為參照物（基因組大小約363 Mb），對(duì)兩份材料進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）分析，結(jié)果表明兩份材料基因組大小和倍性也是一致的，均為2n=3x=42。因此，江芋4號(hào)突變型與江芋2號(hào)野生型材料相比，染色體數(shù)目和倍性上未發(fā)生顯著變化（圖4）。

圖4 120份芋資源的UPGMA聚類(lèi)結(jié)果Fig.4 UPGMA clustering diagram of 120 taro varieties

2.4 變異株及親本遺傳差異SSR標(biāo)記分析

利用38對(duì)SSR引物對(duì)收集到的芋材料DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增和電泳，對(duì)江芋2號(hào)和江芋4號(hào)材料與前期收集到的其他118份芋材料開(kāi)展了遺傳多樣性分析。結(jié)果共擴(kuò)增出97條多態(tài)性條帶，擴(kuò)增片段介于100～800 bp，UPGMA聚類(lèi)分析表明（圖4），所有材料間的相似系數(shù)范圍為0.51～1.00，親本江芋2號(hào)（編號(hào)：T22）與變異株江芋4號(hào)（編號(hào)：T24）遺傳距離最近，兩材料間遺傳相似系數(shù)高達(dá)0.97。

3 討論與結(jié)論

植物體細(xì)胞變異具有發(fā)生率高、變異性狀廣、單基因突變多、變異后代穩(wěn)定快、變異后代基本保持原品種特性等優(yōu)點(diǎn)[18]。通過(guò)植物組織培養(yǎng)產(chǎn)生變異，從中篩選出符合育種目標(biāo)的優(yōu)良變異單株，經(jīng)離體快繁和種植培育，是獲得無(wú)性繁殖作物新品種的重要方法[6,19]。如董偉清等[20]在賀州紅芽芋莖尖組織培養(yǎng)過(guò)程中，從變異單株中篩選出高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、適應(yīng)性強(qiáng)的芋新品種桂子芋1號(hào)。Biswas等[21]通過(guò)離體培養(yǎng)草莓葉片誘導(dǎo)植株再生，從再生的植株中獲得了一系列遺傳變異且園藝性狀得到優(yōu)化的新材料。鄒雪等[6]以西南地區(qū)的馬鈴薯主栽品種‘米拉’為材料，通過(guò)逆境脅迫從組培再生植株中篩選出了新材料‘M-13’。陳麗娟等[22]以廣州番禺地方荸薺品種為材料，通過(guò)組織培養(yǎng)產(chǎn)生體細(xì)胞無(wú)性系變異，在變異群體中篩選優(yōu)良變異單株，采用組培技術(shù)培育而成的荸薺新品種桂蹄2號(hào)。歐昆鵬等[23]在和平粉葛組培變異群體中篩選優(yōu)良變異單株，繼而進(jìn)行離體快繁選育出葛新品種桂粉葛1號(hào)。本研究中，變異株江芋4號(hào)由江芋2號(hào)組培突變而來(lái)，其地下部側(cè)球莖發(fā)生顯著的變異，子芋芋形突變?yōu)殚L(zhǎng)棒狀，莖節(jié)間距明顯變長(zhǎng)，子芋幾乎不膨大，然而突變株江芋4號(hào)地上部生長(zhǎng)旺盛，葉柄和花柄生長(zhǎng)量大，且可食用，可進(jìn)一步開(kāi)發(fā)為食用葉柄和花柄的專(zhuān)用型品種，因其地上部生長(zhǎng)勢(shì)和抗逆性均較強(qiáng)，加之生育期長(zhǎng)，也可進(jìn)一步開(kāi)發(fā)成觀賞用芋品種。

近年來(lái)，RFLP、SSR、SRAP等DNA分子標(biāo)記技術(shù)被廣泛用來(lái)檢測(cè)植株體細(xì)胞無(wú)性系變異是否發(fā)生基因水平的各種變異。本研究利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)親本（江芋2號(hào)）、變異株（江芋4號(hào)）及其他118份芋資源進(jìn)行遺傳聚類(lèi)分析，發(fā)現(xiàn)變異株與親本存在遺傳差異，但其遺傳相似系數(shù)達(dá)97%，這符合體細(xì)胞無(wú)性系變異的規(guī)律，即在組培過(guò)程中，離體培養(yǎng)的植株由于受到激素或培養(yǎng)條件的誘導(dǎo)發(fā)生了某些重要基因的突變、擴(kuò)增或轉(zhuǎn)座子的活化等[24]，有可能引起表型性狀的顯著差異。本研究中，親本江芋2號(hào)側(cè)球莖正常發(fā)育，子芋和孫芋數(shù)量較多，球莖近圓形，而江芋4號(hào)僅在母芋上發(fā)出少數(shù)幾個(gè)棒狀的子芋和孫芋。因此，筆者推測(cè)江芋4號(hào)突變材料可能存在某些主效基因位點(diǎn)突變，從而導(dǎo)致芋葉片和葉柄內(nèi)碳水化合物向地下球莖中轉(zhuǎn)運(yùn)受到抑制，球莖不能膨大，從而促進(jìn)地上部莖葉的生長(zhǎng)和成花，具體變異機(jī)理需要通過(guò)細(xì)胞和分子生物學(xué)手段進(jìn)一步探討。前人研究[25-27]表明作物變態(tài)根莖發(fā)育的相關(guān)性狀多為寡基因或多基因控制的數(shù)量性狀。Quero-García等[28]利用兩個(gè)F1群體對(duì)二倍體檳榔芋母芋產(chǎn)量和主球莖大小相關(guān)的QTL進(jìn)行定位，探測(cè)到多個(gè)產(chǎn)量相關(guān)QTL，并發(fā)現(xiàn)球莖長(zhǎng)、球莖寬QTL與部分產(chǎn)量QTL重合。然而，由于多子芋（2n=3x=42）為三倍體無(wú)性繁殖作物，傳統(tǒng)遺傳學(xué)方法并不能有效應(yīng)用于多子芋性狀的遺傳分析，有關(guān)多子芋球莖發(fā)育調(diào)控的研究鮮有報(bào)道，這也極大限制了多子芋的品種改良和新品種選育工作。多子芋以食用子孫芋等側(cè)球莖為主，側(cè)球莖膨大對(duì)多子芋產(chǎn)量和商品性形成影響重大。本研究中的側(cè)球莖不膨大的體細(xì)胞變異材料，是研究多子芋側(cè)球莖膨大發(fā)育的獨(dú)特優(yōu)異材料，該突變材料的鑒定為后續(xù)研究多子芋膨大調(diào)控機(jī)制提供依據(jù)。