張?chǎng)┫?馮 敏 苗雨露張文智倪 艷?

（1.山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 太原030619； 2.山西省中醫(yī)藥研究院中藥方劑研究所，山西省中藥制劑成型實(shí)驗(yàn)室，山西 太原030012）

還貝止咳方是以現(xiàn)有治療咳嗽變異性哮喘的研究成果為基礎(chǔ)，結(jié)合臨床經(jīng)驗(yàn)所組成的治療小兒咳嗽的經(jīng)驗(yàn)方，由還陽(yáng)參、平貝母、苦杏仁、紫蘇子、黃芩、枳殼、烏梅、甘草等藥材組成，臨床上用于治療咳嗽變異性哮喘、喘息性支氣管炎等肺熱咳嗽，具有清熱肅肺、止咳平喘之功效。臨床上還貝止咳方主要?jiǎng)┬蜑闇珓?，但具有攜帶不便、不能長(zhǎng)時(shí)間保存等缺點(diǎn)，為了適應(yīng)臨床需求，擬將其制成更為輕便的劑型。還貝止咳方藥味較多，成分復(fù)雜，藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制尚未明確，為了確保制劑有效，本實(shí)驗(yàn)對(duì)將選取多個(gè)檢測(cè)指標(biāo)對(duì)其提取純化工藝進(jìn)行優(yōu)化。

G1 法是對(duì)層次分析法進(jìn)行改進(jìn)后的賦權(quán)方法，它不需要構(gòu)建判斷矩陣和一致性檢驗(yàn)，對(duì)指標(biāo)個(gè)數(shù)沒有限制，同時(shí)具有保序性［1］，近年來常與熵權(quán)法結(jié)合使用。熵權(quán)法最先由申農(nóng)引入信息論，目前已在工程技術(shù)［2-3］、社會(huì)經(jīng)濟(jì)［4］等領(lǐng)域得到了非常廣泛的應(yīng)用，其基本思路是根據(jù)指標(biāo)變異性的大小來確定客觀權(quán)重。一般來說，若某個(gè)指標(biāo)的熵值越小，則其變異程度越大，提供的信息量越多，在綜合評(píng)價(jià)中所起到的作用和權(quán)重也越大；反之，若某個(gè)指標(biāo)的熵值越大，則提供的信息量越少，其權(quán)重也越小。將G1 法和熵權(quán)法結(jié)合使用時(shí)，以主觀、客觀2 種評(píng)價(jià)方法結(jié)果的偏離程度最小為原則，通過分別求得兩者權(quán)重比例，綜合考慮了它們對(duì)組合權(quán)重的影響，可有效避免傳統(tǒng)組合賦權(quán)評(píng)價(jià)方法的平均分配主客觀權(quán)重、忽略主客觀評(píng)價(jià)結(jié)果對(duì)權(quán)重影響的做法，從而對(duì)組合系數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)兼顧主客觀權(quán)重時(shí)可提高了數(shù)據(jù)合理性［5］。目前，G1-熵權(quán)法在中醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用鮮有報(bào)道，故本實(shí)驗(yàn)采用該方法和正交試驗(yàn)優(yōu)化還貝止咳方提取純化工藝，結(jié)合多個(gè)指標(biāo)綜合權(quán)重后的綜合評(píng)分，以期篩選出該方最合理可行的工藝參數(shù)，為其進(jìn)一步生產(chǎn)及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器 RE5298A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；DZF-6050 型真空干燥箱（南京沃環(huán)科技實(shí)業(yè)有限公司）；LC-300B 型數(shù)控超聲清洗機(jī)（山東濟(jì)寧魯超超聲設(shè)備有限公司）；TU-1901 型雙光束紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；Ultimate 3000 型高效液相色譜儀，配置ChromeleonTM（變色龍） 色譜工作站（美國(guó)戴安公司）；Hypersil SinoChrom ODS-BP C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，柱號(hào)E2615033，批號(hào)140325）；SE402F 型電子天平［奧豪斯儀器（上海） 有限公司］；BS223S 型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。

1.2 試藥 還陽(yáng)參采自山西省朔州市山陰縣，經(jīng)專家檢驗(yàn)符合《山西省中藥材中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)（第一冊(cè)） 》 還陽(yáng)參項(xiàng)下各項(xiàng)規(guī)定；平貝母、苦杏仁、黃芩、地龍、枳殼、紫蘇子、僵蠶、桃仁、烏梅、甘草等藥材均購(gòu)自安徽省亳州市藥材市場(chǎng)，由山西省中醫(yī)院提供，經(jīng)山西中醫(yī)藥研究院倪艷教授鑒定為正品，均符合2015 年版《中國(guó)藥典》 一部中各藥材項(xiàng)下要求。綠原酸（批號(hào)110753-200413）、黃芩苷（批號(hào)110715-201117 對(duì)照品） 購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。乙醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、磷酸（北京試劑有限公司）、甲醇（西隴化工股份有限公司） 為色譜純；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 綠原酸含有量測(cè)定［6］

2.1.1 色譜條件 Hypersil SinoChrom ODS-BP C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相甲醇（A） -0.4%磷酸（B），梯度洗脫（0～10 min，25%～30%A；10～25 min，30%～33%A）；檢測(cè)波長(zhǎng)327 nm，進(jìn)樣量5 μL。理論塔板數(shù)按綠原酸峰計(jì)算，應(yīng)不低于12 000。

2.1.2 供試品溶液制備 精密稱取各工藝條件下制備的干膏粉約1 g，精密加入20 mL 甲醇，稱定質(zhì)量，超聲30 min，放冷，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，蒸干，殘?jiān)蛹状紡?fù)溶，定容至5 mL，即得。

2.1.3 對(duì)照品溶液制備 精密稱取綠原酸對(duì)照品2.50 mg，加甲醇制成每1 mL 含0.1 mg 綠原酸的溶液，即得。

2.1.4 線性關(guān)系考察 精密量取對(duì)照品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 于10 mL 量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，得 到 0、10、20、30、40、50 μg／mL 溶 液，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X） 進(jìn)行回歸，得到方程為Y＝80.164X（R2＝0.999 2），在0～50 μg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液5 μL，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得綠原酸峰面積RSD 為2.11%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一干膏粉6 份，按“2.1.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣5 μL 測(cè)定，測(cè)得綠原酸含有量RSD 為1.87%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取干膏粉適量，按“2.1.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于0、1、2、4、6、8、10、12 h 在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣5 μL，測(cè)得綠原酸峰面積RSD為1.27%，表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取綠原酸質(zhì)量已知（0.145 0 mg） 的干膏粉約0.5 g，共9 份，加入對(duì)照品溶液（0.1 mg／mL） 0.725、0.725、0.725、1.450、1.450、1.450、2.175、2.175、2.175 mL，按“2.1.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，綠原酸平均加樣回收率為101.45%，RSD 為1.76%。

2.2 總黃酮含有量測(cè)定［7］

2.2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取黃芩苷對(duì)照品1.95 mg，置于50 mL 量瓶中，60%乙醇超聲1 min，放冷，60%乙醇定容至刻度，搖勻，即得（質(zhì)量濃度39 μg／mL）。

2.2.2 供試品溶液制備 精密稱取各工藝條件下制備的干膏粉約0.1 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入20 mL 60%乙醇，密塞，稱定質(zhì)量，超聲30 min，放冷，60% 乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密吸取續(xù)濾液1 mL，置于100 mL 量瓶中，60%乙醇定容至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 檢測(cè)條件 以黃芩苷為對(duì)照品，紫外-可見分光光度計(jì)在278 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定黃酮含有量。

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3 mL，置于10 mL 量瓶中，60%乙醇定容至刻 度，搖 勻，得 到1.95、3.90、5.85、7.80、9.75、11.70 μg／mL 溶液，以空白試劑為參比測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)（A），對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X） 進(jìn)行回歸，得到方程為A＝0.073 7X+0.008 1 （R2＝0.999 8），在1.95～11.70 μg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.5 精密度試驗(yàn)精密稱取干膏粉約0.1 g，按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在278 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度6 次，測(cè)得總黃酮含有量RSD 為0.13%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一干膏粉6 份，按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在278 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，測(cè)得總黃酮含有量RSD 為1.41%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取干膏粉適量，按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在278 nm 波長(zhǎng)處每30 min 測(cè)定1 次吸光度，共2 h，測(cè)得總黃酮含有量RSD 為2.56%，表明溶液在2 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取總黃酮含有量（6.938 9 μg／mL）的供試品溶液9 份，每份10 mL，加入對(duì)照品溶液（70 μg／mL） 0.5、0.5、0.5、1.0、1.0、1.0、1.5、1.5、1.5 mL，搖勻，在278 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，測(cè)得總黃酮平均加樣回收率為100.01%，RSD 為1.79%。

2.3 評(píng)價(jià)指標(biāo)的組合賦權(quán)

2.3.1 G1 法主觀賦權(quán)［8］

2.3.1.1 評(píng)價(jià)指標(biāo)間的序關(guān)系 如果評(píng)價(jià)指標(biāo)x1、x2、…、xm相對(duì)于某評(píng)價(jià)準(zhǔn)則具有關(guān)系式x1＞x2＞…＞xm，則稱評(píng)價(jià)指標(biāo)之間按照“＞” 確立了序關(guān)系。其中，xj表示｛xj｝ 按序關(guān)系“＞” 排定順序后的第j個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)（j＝1、2、…、m）。

2.3.1.2 評(píng)價(jià)指標(biāo)間相對(duì)重要關(guān)系及比較賦值 設(shè)決策者或?qū)＜谊P(guān)于評(píng)價(jià)指標(biāo)間xj-1與xj的重要性程度之比為rj，即權(quán)重評(píng)價(jià)標(biāo)度的理性判斷為公式（1）。

2.3.1.3 評(píng)價(jià)指標(biāo)間的相對(duì)權(quán)重 見式（2） 和（3）。

2.3.2 熵權(quán)法客觀賦權(quán)［9］

2.3.2.1 第j個(gè)指標(biāo)下第i 個(gè)對(duì)象的指標(biāo)值比重Yij見式（4）。

2.3.2.2 第j項(xiàng)指標(biāo)的熵值 見式（5）。

2.3.2.3 指標(biāo)權(quán)重系數(shù) 見式（6）。

2.3.3 組合權(quán)重確定 設(shè)由G1 法得到的主觀權(quán)重為w1，由熵權(quán)法得到的客觀權(quán)重為w2，計(jì)算組合權(quán)重，見式（7）。

2.4 提取工藝優(yōu)化 按照處方（76 g） 稱取相應(yīng)飲片，以總固體得率（干膏質(zhì)量／對(duì)應(yīng)處方藥材質(zhì)量）、總黃酮含有量（供試品中總黃酮質(zhì)量／對(duì)應(yīng)處方藥材質(zhì)量）、綠原酸含有量（供試品中綠原酸質(zhì)量／對(duì)應(yīng)處方藥材質(zhì)量） 為評(píng)價(jià)指標(biāo)，提取時(shí)間（A）、提取次數(shù)（B）、加水量（C） 為影響因素，每個(gè)因素選擇3 個(gè)水平，應(yīng)用L9（34） 正交表進(jìn)行試驗(yàn)。因素水平見表1。

表1 提取工藝因素水平

依據(jù)中藥復(fù)方“君臣佐使” 的配伍原則及與功效相關(guān)的主要有效成分，根據(jù)G1 法確定各評(píng)價(jià)指標(biāo)的順序關(guān)系為總黃酮含有量＞總固體得率＝綠原酸含有量，同時(shí)確定各指標(biāo)的權(quán)重評(píng)價(jià)標(biāo)度r2＝1.3、r3＝1，求得各指標(biāo)的主觀權(quán)重值w1，采用熵權(quán)法計(jì)算各指標(biāo)客觀權(quán)重值w2，計(jì)算各指標(biāo)的組合權(quán)重值w，最后計(jì)算的到各評(píng)價(jià)對(duì)象的綜合評(píng)分Pi，見式（8），并進(jìn)行直觀分析和方差分析。各影響因素權(quán)重值見表2，結(jié)果見表3，方差分析見表4。

表2 提取工藝評(píng)價(jià)指標(biāo)權(quán)重值

表3 提取工藝試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表4 提取工藝方差分析

由直觀分析可知，各因素對(duì)綜合評(píng)分的影響程度依次為B＞A＞C，而且B3＞B1＞B2，A3＞A2＞A1，C2＞C1＞C3；由方差分析可知，各因素對(duì)綜合評(píng)分均無顯著影響（P＞0.05）。為了最大限度的提取該方有效物質(zhì)，保證臨床療效，故選取各影響因素較高水平的組合A3B3C2作為最優(yōu)提取工藝，即加10 倍量水煎煮3 次，每次1.5 h。

然后，放大3 倍處方比例稱取藥材進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見表5，可知該工藝穩(wěn)定可行。

表5 提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）

2.5 純化工藝優(yōu)化 結(jié)合文獻(xiàn)［10-11］ 及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇浸膏量（每1 mL 藥液中的生藥量）、乙醇體積分?jǐn)?shù)［醇沉后藥液中乙醇含有量，加醇量計(jì)算公式見式（9），其中V為加醇量，V1為醇沉前藥液體積，C1為醇沉后藥液中乙醇體積分?jǐn)?shù)，C2為添加乙醇體積分?jǐn)?shù)］、靜置時(shí)間作為影響因素，每個(gè)因素選擇3 個(gè)水平，以總固體得率及總黃酮、綠原酸含有量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，應(yīng)用L9（34） 正交表進(jìn)行試驗(yàn)。因素水平見表6。

表6 純化工藝因素水平

采用G1-熵權(quán)組合賦權(quán)方法（序關(guān)系及權(quán)重評(píng)價(jià)標(biāo)度同“2.4.1” 項(xiàng)） 對(duì)評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行權(quán)重系數(shù)分配，由于純化的目的是減少服用劑量，故總固體得率以低為佳，需將其轉(zhuǎn)換為倒數(shù)后再進(jìn)行計(jì)算，由式（8） 計(jì)算綜合評(píng)分后進(jìn)行直觀分析和方差分析。各影響因素權(quán)重值見表7，結(jié)果見表8，方差分析見表9。

表7 純化工藝評(píng)價(jià)指標(biāo)權(quán)重值

表8 純化工藝試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表9 純化工藝方差分析

由直觀分析可知，各因素對(duì)綜合評(píng)分的影響程度依次為B＞A＞C，而且B1＞B2＞B3，A1＞A2＞A3，C2＞C1＞C3；由方差分析可知，因素A（浸膏量） 和C（靜置時(shí)間） 對(duì)綜合評(píng)分無顯著影響（P＞0.05），而因素B（乙醇體積分?jǐn)?shù)）對(duì)其有顯著影響（P＜0.05）。因此，選取各影響因素較高水平的組合A1B1C2作為最優(yōu)純化工藝，即將浸膏濃縮為1 g／mL生藥量，50%乙醇醇沉后靜置24 h。

然后，放大3 倍處方比例稱取藥材進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見表10，可知該工藝穩(wěn)定可行。

表10 純化工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）

3 討論

中藥復(fù)方發(fā)揮作用不是某種單一成分的獨(dú)立效用，也不是各單味藥藥效作用的簡(jiǎn)單疊加，而是多種有效組分同時(shí)對(duì)機(jī)體的多個(gè)靶點(diǎn)通過多種途徑綜合作用的結(jié)果。還貝止咳方由11 味藥材組成，成分復(fù)雜，如何在提取純化工藝中最大限度保留有效成分并去除雜質(zhì)為核心問題，也是該方后續(xù)研究的最基礎(chǔ)問題。總固體得率對(duì)制劑成型有一定影響，可作為制劑日服量及包裝規(guī)格確定的依據(jù)，同時(shí)也反映了提取溶劑對(duì)藥材有效成分的浸出情況；方中黃芩、枳殼、桃仁等均含黃酮類成分［12-14］，具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗過敏、免疫調(diào)節(jié)等作用，并且綠原酸也具有止咳、祛痰、抗菌、解毒等作用［15-16］，而且為君藥還陽(yáng)參的主要有效成分［17］。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇總固體得率及總黃酮、綠原酸含有量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。

在篩選還貝止咳方最佳提取純化工藝時(shí)，對(duì)評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行權(quán)重是至關(guān)重要的一步，其合理性會(huì)直接影響最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果。目前，對(duì)考察指標(biāo)進(jìn)行權(quán)重的方法可分為三大類［18］，即主觀賦權(quán)法、客觀賦權(quán)法、組合賦權(quán)法，其中主觀賦權(quán)法是決策者根據(jù)自身經(jīng)驗(yàn)對(duì)評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行權(quán)重，雖然有一定參考價(jià)值，但也存在主觀隨意性的風(fēng)險(xiǎn)；客觀賦權(quán)法是根據(jù)實(shí)際數(shù)據(jù)所反映的客觀信息對(duì)評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行權(quán)重，雖然應(yīng)用了嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臄?shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)理論，但缺乏決策者的主觀意圖；本實(shí)驗(yàn)采用組合賦權(quán)法將兩者進(jìn)行線性組合，最終確定權(quán)重系數(shù)，可提高實(shí)驗(yàn)結(jié)論的客觀性與合理性。G1法是專家通過判定某一指標(biāo)的重要程度，按照一定原則實(shí)現(xiàn)對(duì)各指標(biāo)的分值，然后根據(jù)計(jì)算定理確定各指標(biāo)權(quán)重；熵權(quán)法僅利用客觀信息進(jìn)行計(jì)算，為G1 法提供了一個(gè)相對(duì)客觀的指標(biāo)間序關(guān)系，兩者結(jié)合使用可使評(píng)價(jià)指標(biāo)權(quán)重更加科學(xué)合理［19］。

課題組前期對(duì)高速離心法、殼聚糖絮凝法、乙醇沉淀法3 種純化方法進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)殼聚糖絮凝后雖然出膏率偏低，但總黃酮、綠原酸含有量也大大降低，有效成分損失嚴(yán)重；高速離心法雖然操作簡(jiǎn)單，但藥液總固體得率依然較高，藥液澄清度也較差，而且可能存在除雜不徹底等問題；乙醇沉淀法雖然操作相對(duì)復(fù)雜，但可在保留有效成分的前提下大大降低總固體得率，從而更好地達(dá)到降低服用量要求，并且藥液澄明度也更好（澄明度為口服液的重要質(zhì)控指標(biāo)，反映了產(chǎn)品的穩(wěn)定性），可為該方后續(xù)劑型選擇提供了更多可能性。綜上所述，為了提高制劑質(zhì)量，減少服用劑量，本實(shí)驗(yàn)選擇乙醇沉淀法純化還貝止咳方水提液。