嚴(yán)雪梅，彭 倩，許澤恭，周 園，趙鐘祥，廖瓊峰，陳豐連，張 蕾

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州510006）

千斤拔具有補(bǔ)肝腎、祛風(fēng)濕、強(qiáng)腰膝等功效，民間常用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腰腿痛、肺虛久咳、白帶、月經(jīng)不調(diào)等癥［1］，是婦科千金片、金雞膠囊、壯腰健腎丸、活絡(luò)止痛丸等中成藥的主要原料藥［2］。千斤拔為豆科植物蔓性千斤拔Moghania philippinensis（Merr.et Rolfe.） Li.、大葉千斤拔Moghania macrophylla（Willd.） O.Kuntze 或銹毛千斤拔Moghania ferruginea（Wall.ex Benth.） Li.的干燥根［3］。從歷版《中國藥典》 對千斤拔基原的收載情況可見，其應(yīng)用歷史最久，是目前種植和使用的主流品種，且分布最廣，產(chǎn)量最高［4］，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)還未被2015 年版《中國藥典》收錄。目前，蔓性千斤拔質(zhì)量研究主要集中于種植技術(shù)［5-7］和黃酮類成分研究［8-10］，而指紋圖譜研究較少［4，8］。蒙蒙等［4］建立的方法，雖然確立了22 個(gè)共有峰，但只指認(rèn)了5個(gè)。孫輝等［8］只建立并未對指紋數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘?，F(xiàn)有文獻(xiàn)研究對于控制蔓性千斤拔藥材的質(zhì)量不夠全面。HPLC／QTOF-MS 技術(shù)則可以對中藥的化學(xué)成分結(jié)構(gòu)進(jìn)行定性表征，以更有效地控制藥品質(zhì)量；綜合運(yùn)用HPLC 指紋圖譜及HPLC／Q-TOF-MS 技術(shù)，可有效地評價(jià)中藥質(zhì)量，確保藥品療效［11］，因此，本課題組采用HPLC-DAD-QTOF-MS 聯(lián)用技術(shù)研究蔓性千斤拔指紋圖譜，以期為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考。

1 材料

Triple-TOFTM5600+三重四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（美國AB 公司）；LC-20 A 高效液相色譜儀，配有LC-20 AT 二元泵、SPD-M 20 A 二極管陣列檢測器、CTO-20 A 柱溫箱、SIL-20 A 自動進(jìn)樣器和LCsolution 色譜工作站管理軟件（日本島津公司）；AL 204 分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；SB 25-12 DTD 超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司生產(chǎn)）。

乙腈（色譜純，德國默克公司）；甲酸（色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）；蒸餾水［華潤怡寶飲料（中國） 有限公司］；其他試劑均為分析純。藥材購買于廣州市各大藥店或藥材公司，產(chǎn)地為廣東、廣西、湖北、云南等地，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)周勁松副教授鑒定為豆科植物蔓性千斤拔Moghania philippinensis（Merr.et Rolfe.） Li.的干燥根。

2 方法與結(jié)果

2.1 檢測條件

2.1.1 色譜條件 Waters Symmetry C18色譜柱（4.6 mm ×250 mm，5 μm）；流動相0.1% 甲酸水（A） -乙腈（B），梯度洗脫（0～35 min，10%～40% B；35～70 min，40%～70%B；70～105 min，70%～95%B；105～110 min，95%B；110～120 min，95%～10%B）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長254 nm；進(jìn)樣量20 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 ESI 離子源，負(fù)離子模式檢測。離子掃描范圍m／z100～1 500；霧化氣壓379.23 kPa；輔助氣壓力379.23 kPa；氣簾氣壓力341.33 kPa；霧化溫度（TEM）550 ℃；源噴霧電壓（ISVF） 4 500 V；解簇電壓（DP）100 V；碰撞能（CE） 45 V；碰撞活化掃描（CES） 15 V；液相按1 ∶1 分流比進(jìn)入質(zhì)譜，采用Peakview 2.1 軟件對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2.2 供試品溶液制備 蔓性千斤拔根藥材干燥粉碎后過2號篩，稱取樣品粉末約1.00 g，精密稱定，置于50 mL 具塞錐形瓶中，加入甲醇10 mL，超聲（250 W，80 kHz） 提取30 min，濾過；濾渣加入85%乙醇10 mL，繼續(xù)超聲處理30 min，濾過，合并2 次濾液，加甲醇定容至25 mL，搖勻，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 按“2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1.1” 項(xiàng)條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次，測得各共有峰相對保留時(shí)間RSD 小于1.0%，相對峰面積RSD 小于5.0%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.2” 項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6 份，在“2.1.1” 項(xiàng)條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次，測得各共有峰相對保留時(shí)間RSD 小于2.0%，相對峰面積RSD 小于5.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1.1” 項(xiàng)條件下，分別于0、2、4、8、12、16、24 h進(jìn)樣，測得各共有峰相對保留時(shí)間RSD 小于2.0%，相對峰面積RSD 小于5.0%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4 HPLC-DAD 指紋圖譜

2.4.1 指紋圖譜建立 將36 批蔓性千斤拔藥材，按“2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1.1” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣。將得到的色譜圖導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2012A 版），生成色譜疊加圖見圖1。以S2 為參照圖譜，采用平均數(shù)法，時(shí)間窗寬度為0.5 min，經(jīng)多點(diǎn)校正及色譜峰匹配，生成共有模式圖，共標(biāo)定30 個(gè)共有峰，建立了蔓性千斤拔對照指紋圖譜，見圖2。

圖1 36 批樣品HPLC 指紋圖譜

圖2 蔓性千斤拔對照指紋圖譜

2.4.2 聚類分析 本研究以36 批樣品的30 個(gè)共有峰的相對峰面積作為變量，得到36 × 30 階原始數(shù)據(jù)矩陣，導(dǎo)入到SPSS 22.0 軟件，采用組間聯(lián)結(jié)法及歐氏距離作為樣品測度對36 批藥材進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖3。聚類結(jié)果表明，36 個(gè)產(chǎn)地的蔓性千斤拔主要分為2 類，有28 個(gè)不同來源的蔓性千斤拔藥材被聚為一類，表明市售的蔓性千斤拔藥材質(zhì)量相對穩(wěn)定和相似，不具有明顯的地域區(qū)分性。S3、S4、S7、S10、S17、S26、S31、S32 這8 批藥材與其他批次分開，并分為一類。

圖3 36 批樣品聚類樹狀圖

2.4.3 正交偏最小二乘法-判別分析 依據(jù)聚類分析結(jié)果，對已經(jīng)聚為一類的2 組樣品Gr.1 （S1、S2、S5、S6、S8、S9、S11～S16、S18～S25、S27～S30、S33～S36） 和Gr.2（S3、S4、S7、S10、S17、S26、S31、S32） 進(jìn)行正交偏最小二乘法-判別分析。見圖4，所有樣品明顯分為2 類，與聚類分析結(jié)果一致。

圖4 36 批樣品OPLS-DA 得分圖

2.4.4 相似度評價(jià) 將生成的蔓性千斤拔對照指紋圖譜與36 批樣品的色譜圖導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2012A 版），計(jì)算出樣品與對照圖譜的相似度，并用夾角余弦、相關(guān)系數(shù)和歐氏距離計(jì)算相似度，結(jié)果見表1。與對照指紋圖譜相比較，除了S3、S4、S10、S17、S26、S32外，其余各批蔓性千斤拔藥材的相似度都在0.820 以上，表明其質(zhì)量相對穩(wěn)定。比較發(fā)現(xiàn)相似度與聚類分析和OPLS-DA 結(jié)果基本一致，所以相似度分析可用于蔓性千斤拔藥材質(zhì)量一致性評價(jià)。另外，結(jié)合聚類分析和OPLS-DA結(jié)果及相似度結(jié)果，發(fā)現(xiàn)歐氏距離計(jì)算相似度較夾角余弦和相關(guān)系數(shù)能更好的對蔓性千斤拔藥材的差別進(jìn)行識別。

2.4.5 共有峰鑒定 選取色譜信息豐富及與對照指紋圖譜相似度高的一批蔓性千斤拔樣品（S2），按“2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1.1” “2.1.2” 項(xiàng)條件下對蔓性千斤拔的30 個(gè)特征指紋峰進(jìn)行指認(rèn)。利用HPLC／Q-TOFMS 獲得的準(zhǔn)分子離子峰精確相對分子質(zhì)量信息及MS／MS獲得的二級碎片并結(jié)合保留時(shí)間信息等與文獻(xiàn)報(bào)道［12-15］蔓性千斤拔化學(xué)成分進(jìn)行比對，指認(rèn)其中20 個(gè)共有峰的可能結(jié)構(gòu)，見表2。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用甲醇、45% 乙醇、55% 乙醇、65% 乙醇、75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇作提取溶劑，以共有峰峰面積作為評價(jià)指標(biāo)。結(jié)果表明，低濃度乙醇提取液在保留時(shí)間60～100 min 內(nèi)色譜峰面積較小，峰形不佳，而甲醇及85%乙醇提取液均色譜峰數(shù)較豐富，主要色譜峰面積較大，且甲醇提取液中后半段共有峰的峰面積較為明顯，85%乙醇提取液中，前半段共有峰的峰面積較為明顯，故選定第1 次提取溶劑為甲醇，第2 次提取溶劑為85%乙醇的提取方法。同時(shí)，采用全波長掃描，提取254、260、275、320、360 nm 下色譜圖，以色譜峰數(shù)目、豐度和分離度為測評指標(biāo)，確定最佳測定波長為254 nm。另外，對乙腈-0.1% 甲酸和甲醇-0.1%甲酸流動相進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1%甲酸水作流動相進(jìn)行梯度洗脫時(shí)各色譜峰分離度較好。

表1 36 批樣品相似度

表2 36 批樣品共有峰鑒定

續(xù)表2

通過優(yōu)化色譜條件，最終建立了分離度好、色譜峰較全面的蔓性千斤拔HPLC 指紋圖譜，共標(biāo)定了30 個(gè)共有峰。通過HPLC／Q-TOF-MS 指認(rèn)了其中20 個(gè)共有峰。

對36 批樣品進(jìn)行聚類分析，被聚為2 類，不具有明顯的地域區(qū)分性；且相似度都在0.820 以上，提示其質(zhì)量相對穩(wěn)定，聚類分析和正交偏最小二乘法-判別分析與相似度分析結(jié)果基本一致。

千斤拔藥材現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為湖南、上海、廣東等地方藥材標(biāo)準(zhǔn)，僅設(shè)置了性狀、顯微、薄層色譜鑒別等項(xiàng)目，均缺少指紋圖譜等專屬性較強(qiáng)的鑒別項(xiàng)目［7］。本研究采用HPLC-DAD-QTOF-MS 聯(lián)用技術(shù)研究蔓性千斤拔指紋圖譜特征性，以期為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立和后續(xù)的譜效相關(guān)研究提供參考。