商利娜 王亞靜 ?趙 鑫趙海寧周夢楠張 怡高 迪王雁雯葉相印

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津301617； 2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，現(xiàn)代中藥發(fā)現(xiàn)與制劑技術(shù)教育部工程研究中心，天津301617）

黃芩為唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensisGeorgi 的干燥根，其性寒，味苦，歸肺、膽、脾、大腸、小腸經(jīng)［1］，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有清熱祛濕、瀉火解毒等功效；現(xiàn)代藥理學(xué)表明，黃芩提取物具有抗腫瘤、抗病毒、抗微生物、抗炎、抗氧化等作用［2-3］，對多種致病菌的抑制作用是其重要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)之一。黃芩苷是黃芩中含有量最高的成分，也是2015 年版《中國藥典》 規(guī)定的質(zhì)量控制成分。

目前，黃芩提取工藝及質(zhì)量控制大多是根據(jù)《中國藥典》 或文獻(xiàn)，以黃芩苷或總黃酮為指標(biāo)［4-6］，但也有對黃芩譜-效關(guān)系進(jìn)行研究的報道，發(fā)現(xiàn)其抑制金黃色葡萄球菌關(guān)聯(lián)性最強(qiáng)的成分是白楊素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷，而不是黃芩苷［7］。因此，應(yīng)制定適宜的方法進(jìn)行相關(guān)分析，以提高黃芩質(zhì)量控制的科學(xué)性。

另有研究表明，黃芩對白色念珠菌具有一定抑制作用。白色念珠菌是一種常見的條件性真菌病原體，當(dāng)機(jī)體抵抗力低下或菌群失調(diào)時它會大量繁殖并形成芽生菌絲，侵犯皮膚、黏膜或內(nèi)臟，引起鵝口瘡、外科傷口感染、真菌血癥等疾病［8-9］，但目前黃芩抑制白色念珠菌的質(zhì)量標(biāo)志物仍不清晰，因此有必要對相關(guān)質(zhì)量標(biāo)志物進(jìn)行考察。

中藥質(zhì)量標(biāo)志物是在中藥材和中成藥中固有的或加工過程中形成的、與中藥功能屬性密切相關(guān)的化學(xué)物質(zhì)，是反映中藥質(zhì)量和藥效的存在［10］；中藥指紋圖譜是反映中藥所含所有化學(xué)成分種類和數(shù)量的一種形式，在一定程度上可揭示其化學(xué)特征，目前已成為中藥質(zhì)量評價的有效方法，但它僅能反映化學(xué)信息，并不能體現(xiàn)與藥效學(xué)相關(guān)的具體成分［11］，故若要科學(xué)評價中藥質(zhì)量，就應(yīng)開展指紋圖譜與藥效的相關(guān)性研究，即譜-效關(guān)系。

灰色關(guān)聯(lián)分析是一種用于中藥質(zhì)量評估的相關(guān)性分析方法，可定量描述事物或因素之間關(guān)聯(lián)性的大小，也能反映各指標(biāo)性成分對藥效的貢獻(xiàn)程度［12-13］。因此，本實(shí)驗(yàn)采用該方法對黃芩進(jìn)行譜-效關(guān)系研究，根據(jù)各成分貢獻(xiàn)程度來確定該藥材抑制白色念珠菌的質(zhì)量標(biāo)志物。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 高效液相色譜儀，配置Agilent 20RBAX Eclipse Plus 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；LS-B50 L 立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海醫(yī)用核子儀器廠）；SW-CJ-JF 垂直層流超凈工作臺 （蘇州凈化廠）；HPX-9052MBE 電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；Infinite 200 PRO 多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan 公司）；FA124 電子天平（天津億諾科學(xué)儀器有限公司）；YP1001電子天平（上海箐海儀器有限公司）；AX205 電子天平（十萬分之一，瑞士Mettler-Toledo 公司）；默克純水機(jī)（天津信睿生物科技有限公司）；N-1210B 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 黃芩飲片 （批號190102，產(chǎn)地山西） 購自河北安國市譽(yù)林藥業(yè)有限公司，經(jīng)專家鑒定為正品。黃芩苷 （批號P20A9F59353）、黃芩素 （批號C20MBY31962）、漢黃芩 素 （批 號W30M10284622）、橙皮苷（P06D9F77001） 對照品均購于上海源葉生物科技有限公司；漢黃芩苷對照品（批號823B022） 購于北京索萊寶科技有限公司。乙腈、磷酸為色譜純；水為超純水。

1.3 菌種與培養(yǎng)基 白色念珠菌 ［編號BNCC337321（＝ATCC1231）］ 購自北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司。改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基購自北京索萊寶生物科技有限公司；改良馬丁培養(yǎng)基購自山東拓普生物工程有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 供試品溶液 精密稱取4 份藥材粗粉，每份10 g，加入水或60%乙醇200 mL，以回流水提取、回流60%乙醇提取、溫浸水提取、溫浸60% 乙醇提取4 種方式各提取2 h，提取液放涼后，對應(yīng)溶劑補(bǔ)足減失的質(zhì)量，離心棄去藥渣，0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得，4 ℃下備用。

2.1.2 內(nèi)標(biāo)溶液 精密稱取橙皮苷對照品1.47 mg，甲醇定容至25 mL，即得（質(zhì)量濃度為58.8 μg／mL），4 ℃下備用。

2.1.3 對照品溶液 精密稱取黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素對照品適量，甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度分別為0.516、1.000、0.506、0.515 g／L 的貯備液，各吸取1 mL 置于10 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，超聲混勻，0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 抑菌用供試品溶液 取“2.1.1” 項(xiàng)下藥液適量，旋蒸至生藥量1 g／mL，即得。

2.1.5 試驗(yàn)用菌液 將白色念珠菌凍干粉進(jìn)行復(fù)蘇、活化、傳代至第3 代，取10 μL 加到10 mL 改良馬丁液體培養(yǎng)基中，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h，即得（菌濃度為1×107CFU／mL）。

2.2 HPLC 指紋圖譜建立

2.2.1 色譜條件 Agilent ZORBAX Eclipse Plus 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈（A） -0.1% 磷酸（B），梯度洗脫（0～25 min，85%～75% B；25～40 min，75%～70% B；40～45 min，70%～60% B；45～60 min，60%～57% B；60～65 min，57%～30% B；65～70 min，30%～85%B；70～75 min，85% B）；體積流量1 mL／min；檢測波長202 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.2.2 圖譜分析 對照品溶液用0.45 μm 微孔濾膜過濾后，在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖1A；取“2.1.1” 項(xiàng)下供試品溶液1 mL 于5 mL 量瓶中，對應(yīng)溶劑定容至5 mL，取1 mL，與1 mL “2.1.2” 項(xiàng)下內(nèi)標(biāo)溶液混合，0.45 μm 微孔濾膜過濾，在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖1B。

圖1 對照品HPLC 色譜圖及供試品HPLC 指紋圖譜

2.3 體外抑菌實(shí)驗(yàn) 根據(jù)美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI） 操作規(guī)范，采用微量肉湯稀釋法［3，14］進(jìn)行測定，設(shè)置實(shí)驗(yàn)組、陰性對照組、陽性對照組、空白對照組。取無菌96 孔板，在A1～A11 孔中分別加入1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95、0.98 g／L 藥材提取液100 μL，再分別加入100 μL 稀釋至1×104倍的白色念珠菌菌液，使每孔終質(zhì)量濃度分別為500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95、0.98、0.49 g／L，作為實(shí)驗(yàn)組；B1～B11孔中依次加入質(zhì)量濃度為1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95、0.98 g／L 藥材提取液100 μL，再分別加入100 μL 改良馬丁液體培養(yǎng)基，作為陰性對照組；A12 孔中加入滅菌水、稀釋至1×104倍的菌液各100 μL，作為陽性對照組；B12 孔中加入滅菌水、改良馬丁液體培養(yǎng)基各100 μL，作為空白對照，每組平行3 次，將96 孔板置于酶標(biāo)儀中測定600 nm 波長下的吸光度（A），計(jì)算抑菌率，公式為抑菌率＝［1-（A實(shí)驗(yàn)組-A陰性對照組） ／（A陽性對照組-A空白對照組）］ ×100%。

2.4 藥材指紋圖譜數(shù)據(jù)及抑菌效果 藥材指紋圖譜數(shù)據(jù)以各標(biāo)志峰峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值表達(dá)，抑菌效果以供試品溶液質(zhì)量濃度為7.81 g／L 時的抑菌率來表達(dá)（7.81 g／L為藥材抑制白色念珠菌的最低抑菌濃度，此時4 種提取方式下的抑菌率具有顯著差異），結(jié)果見表1。

2.5 灰色關(guān)聯(lián)分析 參考文獻(xiàn)［7，15-16］ 報道的方法。

2.5.1 參考序列、比較序列確定 本實(shí)驗(yàn)考察不同提取工藝下藥材提取液中各成分（即各組分峰面積） 對白色念珠菌抑菌率的影響程度，以抑菌率為參考序列（母序列），記作X0（k），k＝1、2、3、4；以27 種成分峰比值為比較序列（子序列），記作Xi（k），i＝1、2、3、…、27，k＝1、2、3、4。

2.5.2 無量綱化處理 為了確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性，便于各指標(biāo)比較，在計(jì)算灰色關(guān)聯(lián)度之前需要對數(shù)據(jù)進(jìn)行無量綱化處理。本實(shí)驗(yàn)研究采用均值化法，即用各序列元素分別除以相應(yīng)序列平均值，計(jì)算公式為i＝0、1、2、3、…、27，k＝1、2、3、4。其中為序列i的樣本數(shù)據(jù)平均值，Xi（k） 為原數(shù)據(jù)，Xi′ （k） 為無綱量化處理后的數(shù)據(jù)，從而得到均值化的序列｛Xi′ （k） ｝。

表1 藥材指紋圖譜數(shù)據(jù)及抑菌效果

2.5.3 求差數(shù)列建立 計(jì)算參比序列與比較序列的絕對差值ΔXi（k），計(jì)算公式為

2.5.4 關(guān)聯(lián)系數(shù)確定 灰色關(guān)聯(lián)系數(shù)ζi（k） 表示參考序列X0和比較序列Xi在k（k＝1、2、3、4） 時的關(guān)聯(lián)程度，計(jì)算公式為ξi（k）＝（i＝0、1、2、3、…、27，k＝1、2、3、4），式中｜X0（k） -Xi（k） ｜ 為序列X0與序列Xi在k點(diǎn)差值的絕對值；為差值絕對值的二級最小值，即在各序列差值最小值的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步得出所有序列的差值最小值；為差值絕對值的二級最大值，即在各序列差值最大值的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步得出所有序列的差值最大值；ρ為分辨系數(shù)，取值區(qū)間為（0，1），本實(shí)驗(yàn)取ρ＝0.5。

2.5.5 灰色關(guān)聯(lián)度計(jì)算 灰色關(guān)聯(lián)度γ0i計(jì)算公式為，式中n為任一序列i下的樣本數(shù)，本實(shí)驗(yàn)取n＝4。

2.5.6 關(guān)聯(lián)極性分析 序列Xi′ （k） 與X0′ （k） 之間的關(guān)聯(lián)極性 σi計(jì)算公式為（i＝1、2、3、…、27，k＝1、2、3、4，n＝4）。若sgn （σi） ＝sgn （σ0），則Yi與Y0正關(guān)聯(lián)，即前者對后者起到增強(qiáng)作用；若sgn （σi） ＝-sgn （σ0），則Yi與Y0負(fù)關(guān)聯(lián)，即前者對后者起到削弱作用，sgn （X）為符號函數(shù)，即

2.6 分析結(jié)果 按“2.5” 項(xiàng)下方法對譜-效關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果見表2，可知除了成分1、3、8、10、12、14、21、22、26 對抑菌起到削弱作用外，其他成分都起到促進(jìn)作用，各成分對抑菌率的影響程度見圖2～3。在促進(jìn)抑菌活性的成分中，關(guān)聯(lián)度最強(qiáng)的是峰24 （黃芩素），其關(guān)聯(lián)度為0.768 9；對削弱抑菌活性的成分中，關(guān)聯(lián)度最強(qiáng)的是峰22，其關(guān)聯(lián)度為0.624 7，即峰24 （黃芩素）、峰22 分

表2 抑菌質(zhì)量標(biāo)志峰與抑菌率之間的關(guān)聯(lián)度

圖2 對抑制白色念珠菌起促進(jìn)作用的成分及其貢獻(xiàn)程度

圖3 對抑制白色念珠菌起削弱作用的成分及其貢獻(xiàn)程度

3 討論

白色念珠菌是一種條件致病性真菌，是真菌感染的最常見原因之一，并且具有顯著的死亡率。黃芩具有顯著抑制白色念珠菌的活性，而且它屬于天然中藥產(chǎn)物，不易產(chǎn)生耐藥性，故本實(shí)驗(yàn)旨在考察該藥材相關(guān)質(zhì)量標(biāo)志物。

中藥質(zhì)量標(biāo)志物（Q-marker） 是中藥質(zhì)量控制的一個新概念，其核心內(nèi)容包括有效、特有、傳遞與溯源、可測、處方配伍［17］，其中有效最為重要。目前，已有文獻(xiàn)表明黃芩苷、黃芩素等單體成分對白色念珠菌具有抑制作用［19-20］，本實(shí)驗(yàn)印證了這一點(diǎn)，但更著重對黃芩提取物中各成分對抑菌效果的強(qiáng)弱進(jìn)行研究，并將貢獻(xiàn)程度最大的黃芩素作為質(zhì)量標(biāo)志物。中藥是否有效與其化學(xué)成分、提取工藝等因素密不可分，故本實(shí)驗(yàn)設(shè)置4 種提取方式使其化學(xué)成分及藥效（抑菌率） 具有顯著差異，以便通過譜-效關(guān)系確定該藥材抑制白色念珠菌的質(zhì)量標(biāo)志物。

中藥化學(xué)成分十分復(fù)雜，并非所有成分在疾病治療中都起著同樣重要的作用，故需應(yīng)用一種合適的方法對譜-效關(guān)系進(jìn)行研究，以便得到在藥效學(xué)中發(fā)揮作用的貢獻(xiàn)者。中藥譜-效關(guān)系的研究方法很多，如灰色關(guān)聯(lián)分析、相關(guān)分析、聚類分析、偏最小二乘法分析等，其中灰色關(guān)聯(lián)分析具有樣本量小、計(jì)算量小、結(jié)果與定量結(jié)果一致等優(yōu)點(diǎn)［12］。因此，本實(shí)驗(yàn)采用灰色關(guān)聯(lián)分析法對黃芩的“譜-效” 關(guān)系進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其中抑制白色念珠菌關(guān)聯(lián)性最強(qiáng)的成分是黃芩素，而不是含有量最高的黃芩苷。因此，針對中藥中每種特定成分的藥效，均需要制定合適的方法對其譜-效關(guān)系進(jìn)行分析，以便確定其質(zhì)量標(biāo)志物。

本實(shí)驗(yàn)首次采用譜-效結(jié)合模式，從抑菌差異性特點(diǎn)的角度出發(fā)，對黃芩進(jìn)行質(zhì)量綜合評價體系研究，并通過灰色關(guān)聯(lián)分析對不同提取工藝所得黃芩HPLC 指紋圖譜與藥液對白色念珠菌的抑制作用進(jìn)行關(guān)聯(lián)，明確了該藥材抑菌物質(zhì)基礎(chǔ)的關(guān)聯(lián)程度。結(jié)果，初步確定了黃芩抑制白色念珠菌的主要質(zhì)量標(biāo)志物是黃芩素，其藥效發(fā)揮是多種成分共同作用的結(jié)果，可為該藥材提取工藝優(yōu)化、質(zhì)量控制建立等方面的研究提供可行性參考。但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與目前黃芩質(zhì)量控制指標(biāo)（黃芩苷） 不完全符合，具體原因仍需進(jìn)一步探討。