王小龍，亓詠梅，席永寬

（安徽省阜陽(yáng)市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，安徽 阜陽(yáng)236000）

糖尿病腎?。―iabetic nephropathy，DN） 是糖尿病常見(jiàn)的慢性并發(fā)癥之一，也是導(dǎo)致終末期腎?。‥SRD） 的關(guān)鍵因素。我國(guó)住院糖尿病患者腎病的并發(fā)率達(dá)33.6%，約30% 1 型糖尿病和20%～50% 2 型糖尿病患者發(fā)生DN［1］。其中年齡、病程、高血糖、高血壓、血脂紊亂、高尿酸、吸煙、肥胖等是DN 的相關(guān)危險(xiǎn)因素［2］。西醫(yī)對(duì)于早期DN的治療多針對(duì)患者血壓、血脂、血糖的控制來(lái)推遲腎病的出現(xiàn)，后期則以腹膜透析、腎移植為主。雖然臨床上取得了一定的療效，但由于不良反應(yīng)大，患者依從性相對(duì)較差，一定程度上限制了其臨床應(yīng)用。

黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceuus（Fisch.） Bge.var.mongholicus（Bge.） Hsiao 或膜莢黃芪Astragalus membranaceuus（Fisch.） Bge.的干燥根。其味甘、性微溫，主含黃芪多糖、三萜類、黃酮類等化合物，能調(diào)節(jié)血糖、降血壓、降血脂［3］?！吨袊?guó)藥典》 言其主“內(nèi)熱消渴”，一些研究［4-6］也證實(shí)了黃芪對(duì)于DN 的獨(dú)特療效。丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhizaBge.的干燥根及根莖，已有研究［7］證實(shí)丹參提取物能有效降低早期DN 患者的炎癥反應(yīng)，并改善腎血管內(nèi)皮功能。黃芪與丹參相使配伍，益氣與活血并重，氣旺血行，血行氣亦旺，共奏益氣活血、推陳出新之功，有較好的協(xié)同作用，且兩藥一定比例的配伍優(yōu)于單味作用［8-9］。黃芪-丹參配伍能通過(guò)改善DN 大鼠腎臟線粒體呼吸功能及能量代謝，改善DN 大鼠腎臟的功能，故常聯(lián)合用于治療DN，效果顯著［10-11］。本研究借助TCMISS 軟件及BATMAN-TCM 平臺(tái)，以DN 相關(guān)中藥處方為研究對(duì)象，從關(guān)聯(lián)規(guī)則Apriori 算法及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)切入，探討黃芪-丹參組合在DN 中的應(yīng)用規(guī)律、作用靶點(diǎn)及其作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 處方來(lái)源 處方來(lái)源于張光榮主編的《糖尿病效驗(yàn)秘方》［12］一書(shū)，該書(shū)收錄了DN 古今驗(yàn)方92 首，其中同時(shí)出現(xiàn)黃芪-丹參組合的54 首，故將此54 首處方納入本次研究?！短悄虿⌒?yàn)秘方》 由中國(guó)醫(yī)藥科技出版社出版，該書(shū)內(nèi)容豐富、通俗易懂、療效確切、針對(duì)性強(qiáng)，具有一定的代表性。

1.2 數(shù)據(jù)預(yù)處理 數(shù)據(jù)預(yù)處理是數(shù)據(jù)挖掘中極為重要的一環(huán)，針對(duì)中藥方劑數(shù)據(jù)挖掘需要一套以數(shù)據(jù)清洗為主的數(shù)據(jù)預(yù)處理方法，使數(shù)據(jù)規(guī)范、準(zhǔn)確和有序，利于后續(xù)的挖掘處理［13］。為便于統(tǒng)計(jì)、降低數(shù)據(jù)挖掘結(jié)果的偏差，本次研究參考高等院校《中藥學(xué)》［14］教科書(shū)，將藥名進(jìn)行統(tǒng)一化處理。教材中未收錄的，參考《常用中藥別名速查手冊(cè)》 一書(shū)［15］，其余均使用統(tǒng)一的名稱，以確保數(shù)據(jù)的整齊性即可。

1.3 數(shù)據(jù)錄入 將納入研究的的92 首處方藥物由專人錄入“中醫(yī)傳承輔助平臺(tái)（TCMISS） V2.5” 軟件（由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所提供） 中的“平臺(tái)管理” →“方劑管理” 模塊，建立DN 的方劑數(shù)據(jù)庫(kù)。并將相關(guān)數(shù)據(jù)錄入BATMAN-TCM （Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechANism of TCM，http： ／ ／bionet.ncpsb.org／batmantcm／） 平臺(tái)進(jìn)行藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)分析?？紤]到人工錄入可能出現(xiàn)的偏差，完成數(shù)據(jù)錄入后，由另一名研究人員對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行逐條審核，以確保數(shù)據(jù)與原書(shū)相符。

1.4 數(shù)據(jù)提取 進(jìn)入TCMISS 的“數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)模塊”“方劑類別” 下拉框選擇“糖尿病腎病”，“指定中藥” 輸入“黃芪”，點(diǎn)擊“查詢” 按鈕，共搜索出符合條件記錄75 條。將“黃芪” 刪除，再輸入“丹參”，點(diǎn)擊“結(jié)果中查詢” 按鈕，則提取出含有黃芪-丹參藥組的54 首處方。

1.5 數(shù)據(jù)分析 采用TCMISS 軟件中的“數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)”進(jìn)行頻次統(tǒng)計(jì)、關(guān)聯(lián)規(guī)則Apriori 分析、組方規(guī)律分析。運(yùn)用BATMAN-TCM 平臺(tái)進(jìn)行藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)分析。完成數(shù)據(jù)分析后，將數(shù)據(jù)導(dǎo)出，運(yùn)用Microsoft Excel 表格對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行排序整理。

2 結(jié)果

2.1 用藥頻次分析 在 “數(shù)據(jù)提取” 的基礎(chǔ)上，點(diǎn)擊“頻次統(tǒng)計(jì)”，共出現(xiàn)104 味中藥。點(diǎn)擊“藥頻導(dǎo)出”，將每味中藥的出現(xiàn)頻次進(jìn)行求和，共計(jì)607 味次。頻次由高到低的前五味為黃芪、丹參、茯苓、山藥、益母草，出現(xiàn)頻次均≥26 次。用藥頻次≥10 的見(jiàn)表1。藥物功效分類見(jiàn)圖1、表2。

表1 出現(xiàn)頻次≥10 的藥物

圖1 頻次≥2 的藥物一級(jí)功效分類

2.2 基于關(guān)聯(lián)規(guī)則Apriori 算法分析 點(diǎn)擊“組方規(guī)律” 按鈕，根據(jù)高頻藥物組合數(shù)量，通過(guò)將支持度個(gè)數(shù)設(shè)置為19，共出現(xiàn)30 條藥物組合模式，其中包含9 味中藥。見(jiàn)表3。

支持度個(gè)數(shù)為19 條件下，通過(guò)進(jìn)一步將置信度設(shè)置為0.8，點(diǎn)擊“規(guī)則分析”，共出現(xiàn)包含6 味中藥的27 條關(guān)聯(lián)規(guī)則。通過(guò)進(jìn)一步整理，將此27 條關(guān)聯(lián)規(guī)則展示如下，見(jiàn)表4。進(jìn)一步進(jìn)行藥物之間的網(wǎng)絡(luò)圖展示，見(jiàn)圖2。通過(guò)設(shè)置不同的支持度，顯示核心藥物與外圍藥物之間不同的配伍規(guī)則，見(jiàn)圖3～4。

表2 頻次≥2 的藥物二級(jí)功效分類

表3 支持度個(gè)數(shù)為15 條件下的高頻藥物組合模式

表4 Apriori 算法的藥物關(guān)聯(lián)規(guī)則分析

圖2 支持度個(gè)數(shù)19，置信度0.8 條件下藥物關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 支持度個(gè)數(shù)10，置信度0.8 條件下藥物關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 支持度個(gè)數(shù)6，置信度0.8 條件下藥物關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 黃芪-丹參組合的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析 將黃芪-丹參組合錄入BATMAN-TCM 平臺(tái)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，Score cutoff 調(diào)至30，Adjusted P_ value cutoff 調(diào)至0.05，共搜集到相關(guān)化合物192 個(gè)，其中83 個(gè)未發(fā)現(xiàn)化合物結(jié)構(gòu)信息，故其余的109 個(gè)化合物可進(jìn)行靶點(diǎn)、疾病、信號(hào)通路預(yù)測(cè)。信號(hào)通路、GO 功能、相關(guān)疾病的富集分析結(jié)果見(jiàn)表5～7。進(jìn)一步將成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路-疾病進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)圖展示，見(jiàn)圖5。

表5 KEGG 信號(hào)通路分析

表6 GO 功能富集分析

表7 相關(guān)疾病富集分析

3 討論

3.1 黃芪-丹參配伍的高頻藥物分析 本次研究的54 首處方 中，除黃芪、丹參以 外，茯 苓 （57.41%）、山 藥（53.70%）、益母草（48.15%） 使用頻次亦較高，均在26味次以上。且高頻藥物功效主要集中在補(bǔ)虛、活血化瘀、清熱、利水滲濕、收澀等，頻次均≥42 次。通過(guò)進(jìn)一步將高頻藥物進(jìn)行二級(jí)功效分類，發(fā)現(xiàn)高頻藥物以補(bǔ)氣、活血調(diào)經(jīng)、利水消腫、清熱涼血、補(bǔ)血、補(bǔ)陰、固精縮尿止帶藥為主。其中補(bǔ)氣藥與活血調(diào)經(jīng)藥顯著高于其他藥物，與黃芪-丹參的配伍功效相符。

圖5 化合物-靶點(diǎn)-信號(hào)通路-疾病網(wǎng)絡(luò)圖

3.2 黃芪-丹參配伍的高頻藥物關(guān)聯(lián)規(guī)則分析 支持度個(gè)數(shù)是指藥物組合在所選處方中出現(xiàn)的頻次；置信度表示當(dāng)A 藥出現(xiàn)時(shí)，B 藥出現(xiàn)的概率，其關(guān)系用符號(hào)“-＞” 表示。支持度個(gè)數(shù)與置信度均可根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)節(jié)［16］。本次研究根據(jù)高頻藥物組合的數(shù)量，首先將支持度設(shè)置為19，出現(xiàn)了30 條藥物組合模式，其中包含了9 味中藥。進(jìn)一步限制置信度為0.8，出現(xiàn)了6 味節(jié)點(diǎn)中藥，以黃芪-丹參為核心組成了27 條關(guān)聯(lián)規(guī)則，均體現(xiàn)了圍繞脾、腎兩臟的補(bǔ)氣、滋陰、化瘀為主的糖尿病腎?。?7］治療法則。通過(guò)調(diào)整不同的支持度個(gè)數(shù)，可以從網(wǎng)絡(luò)圖中直觀地看出以黃芪-丹參為核心的外圍藥物組合模式。支持度個(gè)數(shù)較低時(shí)，基本能反映出圍繞黃芪-丹參的核心組合；隨著支持度個(gè)數(shù)的升高，藥物數(shù)量增加，可以較全面的顯示出藥物組合的臨床使用情況［18］。當(dāng)支持度個(gè)數(shù)為19 時(shí)，出現(xiàn)了圍繞黃芪-丹參組合的山藥、川芎、茯苓、益母草、生地黃、當(dāng)歸、山茱萸7 個(gè)外圍中藥。支持度個(gè)數(shù)調(diào)整為10 時(shí)，則增加了熟地黃、水蛭、蒼術(shù)等外圍藥物。進(jìn)一步降低支持度個(gè)數(shù)，則較為全面地反映出以黃芪-丹參為核心的藥物組合模式，體現(xiàn)了以補(bǔ)氣健脾、滋陰生津、利水滲濕、活血化瘀的治則治法，反證了DN 脾氣虛弱、脾腎兩虛，陰虛燥熱、本虛標(biāo)實(shí)的病因病機(jī)［19］。

3.3 黃芪-丹參組合的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析本次研究的黃芪-丹參配伍組合中，共有109 個(gè)化合物，進(jìn)一步分析顯示有29 條KEGG 信號(hào)通路及60 條GO 功能顯著富集。而嘌呤代謝、鈣信號(hào)途徑、腎素-血管緊張素系統(tǒng)、炎癥免疫介質(zhì)、以及線粒體凋亡途徑等均參與了DN 的發(fā)?。?0-22］。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS） 是一種與血管密切相關(guān)的內(nèi)分泌系統(tǒng)，在糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制有著極其重要的作用，局部AngⅡ的增多可以通過(guò)增加腎小球出球小動(dòng)脈的壓力，并抑制足突細(xì)胞去氧腎上腺素的表達(dá)，加上糖尿病患者的高血糖狀態(tài)晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs） 的形成和排泄增多，導(dǎo)致尿蛋白的超濾過(guò)，進(jìn)而加重足細(xì)胞的損傷，并進(jìn)一步激活RAAS，造成惡性循環(huán)，從而引起持續(xù)性蛋白尿、腎小球硬化及進(jìn)行性腎功能惡化［23-25］。此外，線粒體功能紊亂可引起慢性微炎癥狀態(tài)、基質(zhì)降解及血管內(nèi)皮的纖維化，而發(fā)生機(jī)制均有Ca2+通道的異常調(diào)控的參與，其機(jī)制可能為Ca2+通過(guò)激活一氧化氮合酶活性，上調(diào)一氧化氮水平，抑制呼吸鏈中復(fù)合體Ⅳ活性，增加活性氧類含有量，而活性氧類大量積聚以及細(xì)胞鈣調(diào)節(jié)紊亂的出現(xiàn)，加劇細(xì)胞壞死，導(dǎo)致機(jī)體損傷與修復(fù)并行，加重DN 血管病變［26-28］。另一方面，在DN 的發(fā)生發(fā)展中，TNF-α、MCP-1、IL-6、ICAM-1 等炎性細(xì)胞因子也起著重要作用，炎癥因子表達(dá)增多可促進(jìn)炎性巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)，最終導(dǎo)致腎小球基膜產(chǎn)生增多，加速腎小球硬化進(jìn)程，從而加快DN 的病情進(jìn)展［29-30］?！靶皻馐t實(shí)，精氣奪則虛《素問(wèn)·通評(píng)虛實(shí)論》”，RAAS 系統(tǒng)、線粒體功能紊亂，以及致炎因子表達(dá)的增多等均密切參與了DN 患者“本虛” “邪實(shí)” 的病理進(jìn)程，反映了DN 多途徑、多環(huán)節(jié)、虛實(shí)相兼的發(fā)病特點(diǎn)。基于DN “陰虛燥熱，本虛標(biāo)實(shí)” 的病因病機(jī)，黃芪-丹參一補(bǔ)一瀉相使為伍，其極有可能通過(guò)調(diào)節(jié)鈣信號(hào)途徑進(jìn)而影響線粒體凋亡，同時(shí)影響腎素-血管緊張素系統(tǒng)、以及炎癥免疫介質(zhì)的表達(dá)而發(fā)揮氣血同治、補(bǔ)瀉兼施的治療特色。TTD／OMIM 中靶點(diǎn)≥2 的相關(guān)疾病富集分析結(jié)果顯示，如高血壓病、神經(jīng)癥、腎臟疾病、肥胖、缺血性腦中風(fēng)等，這些大多是糖尿病或DN 的常見(jiàn)并發(fā)癥或伴隨癥狀，而以黃芪-丹參配伍的組合或可成為這些疾病的潛在治療藥物，值得進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，本次研究搜集了54 首含有黃芪-丹參組合治療DN 的處方，借助TCMISS 的關(guān)聯(lián)規(guī)則Apriori 算法，得出黃芪、丹參、茯苓、山藥、益母草為治療DN 的高頻藥物。通過(guò)設(shè)置不同的支持度個(gè)數(shù)，進(jìn)一步挖掘出由少至多、由核心到外圍的黃芪-丹參相關(guān)組合模式。這些組合基本反映了DN 的病因病機(jī)和治則治法。進(jìn)一步借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，從微觀層面探討了黃芪-丹參組合治療DN的作用靶點(diǎn)和作用機(jī)制。然而由于本次研究的樣本量相對(duì)較少，難以較全面體現(xiàn)該病的治療用藥規(guī)律，有待于進(jìn)一步的臨床及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。