黃 巧，尹時華，翟思佳，廖行偉，劉宇超

（廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，廣西 南寧530007）

突發(fā)性耳聾通常是單側(cè)的，其病因尚未明確，可能的原因包括感染（尤其是病毒）、自身免疫性疾病、循環(huán)系統(tǒng)疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病［1］。目前治療包括全身應(yīng)用類固醇、鼓室內(nèi)注射類固醇、口服抗病毒藥物、血管擴張劑、高壓氧治療和中醫(yī)治療等［2］。銀杏葉提取物主要成分為總黃酮及白果總內(nèi)酯，具有擴張血管、增加血流量、清除氧自由基、抗炎等作用［3］。研究表明，口服銀杏葉提取物（EGb761） 能減輕水楊酸鈉誘導(dǎo)的豚鼠耳蝸血管中血流減少；腹腔注射EGb761 對順鉑誘導(dǎo)的大鼠耳毒性具有保護作用，如ABR 聽力閾值偏移、保護內(nèi)耳蝸電位和毛細胞完整性；此外，EGb761 還顯著抑制噪音誘發(fā)的耳鳴［4］。目前銀杏葉提取物（金納多） 也被廣泛用于突發(fā)性耳聾的臨床治療，但其作用機制尚未明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過對生物學(xué)數(shù)據(jù)全面分析，構(gòu)建藥物-疾病靶點網(wǎng)絡(luò)，從多層面揭示中藥活性成分與疾病的相互作用機制［5］。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，分析銀杏葉提取物活性成分、靶點，探討其治療突發(fā)性耳聾的作用機制。

1 材料與方法

1.1 活性成分及靶點篩選 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺（TCMSP，http： ／ ／lsp.nwu.edu.cn／tcmsp.php） 檢索銀杏葉所有化學(xué)成分，根據(jù)口服利用度（OB） 和類藥性（Druglikeness，DL），篩選出OB≥30% 且DL≥0.18 的化學(xué)成分作為銀杏葉活性成分。經(jīng)GeneCards 數(shù)據(jù)庫 （https： ／ ／www.genecards.org／） 篩選銀杏葉活性成分靶點基因及與突發(fā)性耳聾相關(guān)的基因，根據(jù)相關(guān)性分數(shù) （Relevance score） ≥10 作為候選靶點基因。

1.2 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與功能分析 通過String 數(shù)據(jù)庫獲得疾病靶點PPI 數(shù)據(jù)，篩選得分≥0.4 的PPI 數(shù)據(jù)進行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建［6］。應(yīng)用Cytoscape3.7.1 軟件構(gòu)建成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)。利用插件ClueGO 對銀杏葉提取物治療突發(fā)性耳聾的潛在靶點進行GO 分析和KEGG 通路分析。

2 結(jié)果

2.1 活性化合物篩選及成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 經(jīng)過篩選獲得27 種活性成分（表1）、307 個活性成分靶點和744 個疾病靶點。利用Uniprot 數(shù)據(jù)庫對靶點標準化，并去除重復(fù)靶點，最終獲得223 個活性成分靶點和744 個疾病靶點。將活性成分與其作用靶點導(dǎo)入Cytoscape3.7.1 軟件構(gòu)建成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖（圖1），該網(wǎng)絡(luò)由235 個節(jié)點（12 種活性成分和223 個靶點），306 條邊組成。通過String 數(shù)據(jù)庫獲得疾病靶點PPI 數(shù)據(jù)，篩選得分≥0.4 的PPI 數(shù)據(jù)，并導(dǎo)入Cytoscape 構(gòu)建疾病靶點網(wǎng)絡(luò)互作圖（圖2），該網(wǎng)絡(luò)由416 個節(jié)點和3 624 條邊組成。利用merge 功能將成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖與疾病靶點網(wǎng)絡(luò)互作圖合并，得到由627 個節(jié)點、3 930 條邊組成的成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)圖（圖3），其中包括12 個銀杏葉提取物活性化合物和24 個銀杏葉提取物治療突發(fā)性耳聾的預(yù)測靶點（表2）。

表1 27 種銀杏葉活性成分

圖1 銀杏葉活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)

圖2 突發(fā)性耳聾靶點網(wǎng)絡(luò)

圖3 成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)

2.2 功能分析 利用插件ClueGO 對24 個銀杏葉提取物治療突發(fā)性耳聾的預(yù)測靶點進行功能分析，獲得P＜0.05的37 條GO 分析結(jié)果、37 條KEGG 信號通路分析結(jié)果。GO 分析富集在細胞穩(wěn)態(tài)，激活參與凋亡過程的半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性，自噬的負調(diào)控，脂肪酸氧化與代謝，激素分泌的負調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)單加氧酶、一氧化氮合酶與端粒酶活性，對單胺及兒茶酚胺的反應(yīng)，調(diào)節(jié)淋巴細胞凋亡過程，不存在配體時外源性凋亡信號通路等生物過程（圖4）。KEGG 信號通路富集在卡波西肉瘤相關(guān)的皰疹病毒感染、細胞凋亡、甲狀腺激素信號通路、HIF-1 信號通路、AMPK 信號通路、T 細胞受體信號通路、TNF 信號通路、PPAR 信號通路、p53 信號通路、VEGF 信號通路、雌激素信號通路、催乳素信號通路、B 細胞受體信號通路等37條信號通路（圖5）。經(jīng)查閱文獻，發(fā)現(xiàn)與耳聾相關(guān)的信號通路有脂肪酸降解［7］、HIF-1 信號通路［8］、p53 信號通路［9］、AMPK 信號通 路［10］、細胞凋 亡［11］、TNF 信號通路［12］、雌激素信號通路［13］、甲狀腺激素信號通路［14］、2型糖尿 病［15］、乙型肝炎［16］、結(jié)直腸 癌［17］、膠質(zhì)瘤［18］、黑色素瘤［19］、慢性粒細胞白血?。?0］、自身免疫性甲狀腺疾?。?1］。

表2 銀杏葉提取物治療突發(fā)性耳聾的預(yù)測靶點

圖4 預(yù)測靶點的GO 分析

3 討論

圖5 預(yù)測靶點的KEGG 通路分析

突發(fā)性耳聾為原因不明的急性聽力損失，隨著研究不斷深入，迄今為止涉及的一些機制和途徑包括耳蝸血管閉塞、炎癥、氧化應(yīng)激、鉀和鈣失調(diào)、線粒體功能障礙和細胞凋亡等［4，22］。銀杏葉提取物主要含總黃酮及白果總內(nèi)酯，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析技術(shù)，發(fā)現(xiàn)銀杏葉提取物治療突發(fā)性耳聾的主要藥效成分有槲皮素、兒茶素、山柰酚、銀杏內(nèi)酯、木犀草素-4′-葡萄糖苷、β-谷甾醇、油酸乙酯、亞麻酸乙酯、木犀草素等。順鉑對聽覺損害明顯，用于耳聾模型的制備［23］，有研究顯示，銀杏內(nèi)酯B 通過上調(diào)miR214 減少p53 介導(dǎo)的NOX4／p66 （shc） 途徑，減少超氧化物的產(chǎn)生和細胞凋亡，從而達到對順鉑誘導(dǎo)的細胞毒性的保護作用［24］；山柰酚通過誘導(dǎo)HO-1 表達，增加細胞GSH 和GCLC 水平，從而抑制順鉑誘導(dǎo)的細胞凋亡［25］；槲皮素可以減輕慶大霉素誘導(dǎo)的大鼠耳毒性和組織病理學(xué)損傷，對順鉑誘導(dǎo)的斑馬魚細胞凋亡具有保護作用［26-27］，此外，槲皮素還具有降低抗氧化活性，保護耳蝸免受噪音誘發(fā)的聽力損失［28］。鼓室內(nèi)給予兒茶素對輻射誘導(dǎo)大鼠的聽力損失具有保護作用，其能顯著降低c-Jun N 末端激酶（p-JNK）、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（p-ERK） 切割的半胱天冬酶-3 和PARP 的表達，阻止ROS 的產(chǎn)生抑制絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs），這些結(jié)果表明兒茶素顯著抑制輻射誘導(dǎo)的聽覺毛細胞凋亡，并且兒茶素可能是預(yù)防輻射誘導(dǎo)的耳毒性的安全有效的候選治療［29］。亞麻酸乙酯可以增加ERK 和JNK 活性［30］，ERK 在內(nèi)耳毛細胞中的功能是有爭議的。據(jù)報道在神經(jīng)感覺上皮細胞中，抑制MAPK／ERK1／2顯著降低新霉素（8 h） 治療引起的內(nèi)毛細胞死亡，表明ERK 的激活可能促進內(nèi)耳毛細胞死亡；相反，一些研究報道ERK 的活性形式充當了生存因子，MEK1／2 的長期抑制（約48 h） 導(dǎo)致內(nèi)耳毛細胞死亡，這表明內(nèi)耳毛細胞中ERK 激活的基礎(chǔ)水平對其存活至關(guān)重要［31］。亞麻酸乙酯有可能通過增加ERK 活性從而抑制內(nèi)耳毛細胞凋亡，達到治療突發(fā)性耳聾的目的，但其需進一步研究。β-谷甾醇具有抗炎作用［32］，研究表明免疫／炎癥反應(yīng)可能是突發(fā)性耳聾的發(fā)病機制，β-谷甾醇可能通過控制炎性細胞因子的產(chǎn)生在一定程度上改善耳聾的程度。這進一步證實了篩選出的銀杏葉活性化合物可用于治療突發(fā)性耳聾預(yù)測的研究。

篩選出 的潛在 靶點有 KCNH2、BDNF、NOS3、ADIPOQ、CASP3 等。KCNH2 又稱HERG，它編碼介導(dǎo)心臟復(fù)極電流IKr的K+通道，MinK 與HERG 關(guān)聯(lián)能增加電流幅度。在內(nèi)耳中，已經(jīng)證明MinK 和KCNQ1 在血管紋的邊緣細胞中的表達，并且二者中任一蛋白的無效缺失都能消除耳蝸電位［33］。然而，HERG 在內(nèi)耳K+通道中的作用尚不清楚，銀杏葉提取物是否能通過作用于它影響耳蝸電位，進而改善聽力有待研究。BDNF 表達于成人內(nèi)耳的耳蝸毛細胞和支持細胞的頂端極中，BDNF 和神經(jīng)營養(yǎng)因子受體是人類早期內(nèi)耳發(fā)育過程中的重要參與者，對感覺神經(jīng)元存活和胚胎內(nèi)耳中感覺上皮細胞的神經(jīng)元投射的建立至關(guān)重要［34］。小鼠耳蝸中的BDNF 缺失導(dǎo)致內(nèi)毛細胞突觸的胞吐作用減少，并減少聲音誘導(dǎo)的聽覺腦干反應(yīng)［35］。血管內(nèi)皮是血管活性物質(zhì)，如一氧化氮（NO） 的來源，其調(diào)節(jié)血管平滑肌張力和血流。最近的研究表明NO 也可能在耳蝸血流調(diào)節(jié)中起重要作用，NO 生物利用度的降低可能導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙、耳蝸血液供應(yīng)減少以及耳蝸的組織學(xué)和聽覺改變，低內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS） 活性可能導(dǎo)致聽力損失［36］。Wu 等［37］通過測量736 名受試者中血漿脂聯(lián)素顯示，ADIPOQ基因型可能通過調(diào)節(jié)血漿脂聯(lián)素水平對聽力水平產(chǎn)生影響。HIF1A 是使細胞在缺氧條件下存活的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，Chung 等［38］研究發(fā)現(xiàn)HIF1A 上調(diào)可以防止BALB／c 雜交小鼠噪聲誘導(dǎo)的聽力損失。db／db 小鼠伴有明顯的聽閾閾值升高和毛細胞丟失，Lin 等［8］研究發(fā)現(xiàn)，在db／db 小鼠耳蝸中HIF1A 水平表達顯著增加，信息調(diào)節(jié)子（sirtuin1，SIRT1） 過表達能顯著抑制高糖誘導(dǎo)的HIF1A 水平。細胞周期蛋白D1 抑制對于毛細胞的靜止很重要，同時維持細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的表達，支持細胞增殖活性的急劇下降與細胞周期蛋白D1 下調(diào)相平行，因此，細胞周期蛋白D1 對支持細胞的增殖可塑性起著關(guān)鍵作用，支持細胞中靶向細胞周期蛋白D1 誘導(dǎo)可能是內(nèi)耳增殖再生的途徑［39］。CASP3 為細胞凋亡因子，慶大霉素與水楊酸鈉上調(diào)內(nèi)耳毛細胞和螺旋神經(jīng)節(jié)CASP3 表達，引起細胞凋亡［40-41］。經(jīng)典Wnt 信號傳導(dǎo)是前庭毛細胞再生的有效調(diào)節(jié)劑，研究表明，在小鼠中Wnt 信號傳導(dǎo)效應(yīng)物β-連環(huán)蛋白可以通過增加通過經(jīng)典Wnt 途徑的信號來促進感覺毛細胞的再生［42-43］。慶大霉素注射誘導(dǎo)螺旋神經(jīng)節(jié)凋亡可能受凋亡的Fas-FasL 信號通路控制，研究［44］發(fā)現(xiàn)，過量谷氨酸暴露和Fas-FasL 信號通路活性升高可誘導(dǎo)解離的螺旋神經(jīng)節(jié)細胞凋亡。研究表明MAPK1／MAPK3 激活以及隨后的信號驅(qū)動外毛細胞死亡，MAPK1 信號傳導(dǎo)作為順鉑誘導(dǎo)的細胞凋亡和耳蝸毛細胞丟失的增強因子，siMAPK1 負載納米粒子治療可作為順鉑耳毒性副作用的治療策略［45］。目前越來越多的研究致力于PPARs，包括PPARα、PPARβ／δ和PPARγ，這些受體在脂質(zhì)傳感器和多種代謝途徑中起著重要的生理作用，PPAR 通過上調(diào)抗氧化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和抑制ROS 的產(chǎn)生參與氧化還原平衡的調(diào)節(jié)［46］。PPARγ和PPARα 蛋白存在于聽覺毛細胞和小鼠耳蝸中的其他細胞類型中，PPAR 激動劑，如吡格列酮通過阻斷增加的ROS、脂質(zhì)過氧化，增強細胞抗氧化防御，有效地防止慶大霉素對毛細胞的毒性，鼓室內(nèi)注射吡格列酮可被認為是減輕噪音誘發(fā)的聽力損失和耳蝸損傷、減少炎癥信號和恢復(fù)耳蝸氧化還原平衡的有效治療策略［47］。以上靶點大多與炎癥、氧化應(yīng)激、鉀和鈣失調(diào)、線粒體功能障礙和細胞凋亡有關(guān)，銀杏葉提取物治療突發(fā)性耳聾的機制可能是通過以上關(guān)鍵靶點發(fā)揮作用。

本研究通過功能分析發(fā)現(xiàn)，關(guān)鍵靶點參與細胞穩(wěn)態(tài)、細胞凋亡、自噬的負調(diào)控、調(diào)節(jié)單加氧酶、一氧化氮合酶與端粒酶活性等生物過程；通路富集在細胞凋亡、AMPK信號通路、T 細胞受體信號通路、TNF 信號通路、PPAR 信號通路、p53 信號通路等。Wang 等［48］以過氧化氫誘導(dǎo)氧化應(yīng)激為模型，發(fā)現(xiàn)銀杏葉提取物不僅能減弱過氧化氫誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和促進小鼠離體耳蝸神經(jīng)干細胞的活力，可以逆轉(zhuǎn)關(guān)鍵的內(nèi)在凋亡途徑因子的變化，包括Bcl-2、Bax 和caspase-3，從而支持銀杏葉提取物在預(yù)防氧化應(yīng)激相關(guān)聽力損失方面的潛在治療價值。

綜上所述，銀杏葉提取物中槲皮素、兒茶素、山柰酚、銀杏內(nèi)酯、β-谷甾醇、亞麻酸乙酯等活性化合物可能靶向作用于KCNH2、BDNF、NOS3、ADIPOQ、CASP3 等多個靶點，參與細胞穩(wěn)態(tài)、細胞凋亡、自噬的負調(diào)控等多個生物過程，并通過細胞凋亡、AMPK 信號通路、T 細胞受體信號通路、TNF 信號通路、PPAR 信號通路、p53 信號通路等多條信號通路調(diào)節(jié)內(nèi)耳的鉀和鈣平衡、炎癥、氧化應(yīng)激、線粒體功能和細胞凋亡，進而達到治療突發(fā)性耳聾的目的。然而，這需要更多的研究進一步證實。