樊亞梅，王 建，黃 維，黃 華，陳 念，董泰偉

（成都中醫(yī)藥大學藥學院，四川 成都611137）

2015 年版《中國藥典》 收載了冰片的3 個藥品，分別為天然冰片［樟科植物樟Cinnamomum camphora（L.） Presl新鮮枝、葉經(jīng)提取加工制成的結晶］、艾片［菊科植物艾納香Blumea balsamifera（L.） DC 新鮮葉經(jīng)提取加工制成的結晶］、合成冰片（合成龍腦）。三者性微寒或涼，味辛、苦，歸心、脾、肺經(jīng)，均具開竅醒神、清熱止痛的功效［1］，可用于熱病神昏、驚厥、中風痰厥、氣郁暴厥、中惡昏迷、胸痹心痛、目赤、口瘡、咽喉腫痛、耳道流膿等?，F(xiàn)代藥理研究［2］表明，冰片具有抗炎、鎮(zhèn)痛、促透、保護循環(huán)系統(tǒng)等作用。在循環(huán)系統(tǒng)方面，其對心肌缺血模型大鼠的保護作用與增加冠狀動脈血流量、降低心肌耗氧量、抑制炎癥反應等相關。

目前冠心病（coronary heart disease，CHD） 已成為全球的重要死因。世界衛(wèi)生組織估計在2015 年約740 萬人死于CHD，占全球死亡總數(shù)的13%［3］。CHD 屬中醫(yī)“胸痹”“心痛” 范疇，中醫(yī)臨床上常用冰片配伍他藥進行防治。常用的中成藥有冠心蘇合丸、蘇冰滴丸、速效救心丸等，其所含成分冰片在治療心血管疾病方面發(fā)揮了重要作用。有研究［4］發(fā)現(xiàn)，冰片對異丙腎上腺素所致急性心肌缺血損傷模型大鼠的心肌保護作用機制可能與減輕細胞內(nèi)鈣超載、抑制細胞凋亡等相關。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)冰片對心肌缺血模型大鼠有一定改善作用，可能與抗缺氧、抗自由基損傷、抑制炎癥反應、改善能量代謝障礙等多個過程相關［5］。冰片在治療心血管疾病方面的研究已取得一定成果，但是3 種冰片治療CHD 的關鍵靶點及通路尚未完全清楚，故本研究采用分子對接技術結合網(wǎng)絡藥理學探討3 種冰片調(diào)控CHD 的關鍵靶點及相關通路。

1 材料與方法

1.1 材料 中藥臺灣數(shù)據(jù)庫 （TDT，http： ／ ／tcm.cmu.edu.tw／），有機小 分子生 物活性 數(shù)據(jù)庫 （PubChem，https： ／ ／pubchem.ncbi.nlm.nih.gov／），反向藥效團匹配數(shù)據(jù)庫 （Pharmmapper，http： ／ ／ lilab.ecust.edu.cn／pharmmapper／），人類基因和基因表型綜合數(shù)據(jù)庫（OMIM，http： ／ ／ www.omim.org／），交互蛋 白數(shù)據(jù) 庫 （DIP，http： ／ ／dip.doe-mbi.ucla.edu），RCSB 數(shù)據(jù)庫（http： ／ ／www.rcsb.org／），David 6.8 （https： ／ ／david.ncifcrf.gov／home.jsp），KOBAS 3.0 （http： ／ ／kobas.cbi.pku.edu.cn／），Cytoscape 3.6.1，Discovery Studio 3.5。

1.2 配體準備 通過TDT 與PubChem 獲得天然冰片、艾片、合成冰片主要成分（右旋龍腦、左旋龍腦、龍腦和異龍腦） 及硝酸甘油（陽性對照） 的化學結構，保存為?.mol2 或SDF 格式。

1.3 靶點篩選 利用PharmMapper 預測3 種冰片主要成分的潛在靶點。借助OMIM 篩選與CHD 相關的基因靶點。通過DIP 數(shù)據(jù)庫將以上成分、靶點連接成網(wǎng)絡。使用Cytoscape 3.6.1 將構建的網(wǎng)絡進行可視化分析，利用Network Analyzer 分析網(wǎng)絡中每個點的拓撲參數(shù)，選擇拓撲參數(shù)值Degree （度值），Betweenness Centrality （中介中心性） 與Closeness Centrality （接近中心性） 分別大于所有點中位數(shù)均值2、1、1 倍的靶點作為重要靶點，且將藥物與疾病的共同重要靶點用于分子對接，基于RCSB 數(shù)據(jù)庫下載共同重要靶點的晶體結構，保存其PDB 序號。

1.4 分子對接

1.4.1 準備配體 在Discovery Studio 3.5 軟件的同一窗口導入3 種冰片及硝酸甘油的化學成分，通過Prepare Ligands對所有分子進行準備操作。

1.4.2 準備蛋白 將RCSB 數(shù)據(jù)庫中下載的蛋白晶體結構導入Discovery Studio 3.5 軟件，利用Clean Protein 對蛋白結構進行優(yōu)化處理，去除配體分子、去水、加氫、補全殘基等過程，然后定義蛋白、尋找蛋白結合位點。

1.4.3 分子對接過程 將準備好的配體依次與準備好的蛋白通過LigandFit 模式進行分子對接。在參數(shù)面板中，選擇準備好的受體，指定活性位點；然后選擇所有準備好的配體分子；默認其余設置，運行。

1.5 結果評價 通過Consensus Score 模塊選擇LigScore1、LigScore2、PLP1、PLP2、Jain、PMF、DOCK SCORE 7 種打分函數(shù)對結果進行一致性評價。記錄各配體分子與靶點蛋白結合一致性打分最高的得分，并記錄得分最高構象的氫鍵數(shù)，用于后續(xù)分析。

1.6 GO 與KEGG 富集分析 將分子對接結果較好的靶點通過David 6.8 中的基因ID 轉換工具將共同重要靶點的Uniprot ID 轉換為Entrez Gene ID，再導入KOBAS 3.0 進行KEGG 與GO 富集分析。

2 結果

2.1 篩選靶點 借助網(wǎng)絡藥理學方法，使用Network Analyzer分析所構建網(wǎng)絡（圖1） 中每個點的拓撲參數(shù)度值，中介中 心性與 接近中心性，結果分別 為1、0、0.271 707 03；選擇拓撲參數(shù)度值＞2，中介中心性＞0，接近中心性＞0.271 707 03 的靶點作為重要靶點。篩選出3 種冰片與CHD 的共同重要靶點6 個，分別為過氧化物酶體增殖體活化受體（PPARG）、一氧化氮合酶3 （NOS3）、基質金屬蛋白酶3 （MMP3）、3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A 還原酶（HMGCR）、雌激素受體1 （ESR1）、細胞色素P450 家族第2 亞族C9 （CYP2C9），共同重要靶點的拓撲參數(shù)分析見表1。查閱文獻發(fā)現(xiàn)PPARG 參與調(diào)控眾多靶基因，在脂質代謝、胰島素敏感性、肥胖和動脈粥樣硬化中發(fā)揮重要作用；一項研究發(fā)現(xiàn)載脂蛋白與PPARG CT 基因型之間在影響CHD 的發(fā)生上存在顯著的相互作用［6］。NOS3 誘導釋放的NO 可促進血管舒張，參與血管生成環(huán)節(jié)；在心血管疾病發(fā)展過程中，NOS3 表達異常可導致NO 的不穩(wěn)定，進而出現(xiàn)血管內(nèi)皮功能紊亂，導致動脈粥樣硬化等疾病發(fā)生［7］。細胞外基質的過度降解是動脈粥樣易損斑塊形成的重要原因之一，而MMP3 可以降解幾乎所有細胞外基質成分，并激活其他基質金屬蛋白酶類 （MMPs） 共同降解ECM，從而參與CHD 進程［8］。HMGCR 與CHD 和血脂代謝異常有關，并參與了血脂的調(diào)控［9］。雌激素對心血管的功能取決于ESR1 和ESR2，其分別編碼ERα 和ERβ；其中ERα 參與了血管舒張、心肌細胞凋亡、刺激新血管的形成等，對心臟發(fā)揮了更重要的保護作用［10］。CYP2C9 在血管平滑肌細胞中參與了從花生四烯酸合成環(huán)氧花生酸（EET）的代謝過程，而EET 能夠影響血壓和血管內(nèi)皮功能，因而提示CYP2C9 可能會影響CHD 的發(fā)?。?1］。

圖1 3 種冰片與CHD 重要靶點交互網(wǎng)絡圖

表1 3 種冰片對CHD 共同重要靶點的拓撲參數(shù)分析

2.2 分子對接 3 種冰片成分進行結構優(yōu)化變構后，龍腦與右旋龍腦合并成為同一構象，左旋與異龍腦未改變構象。依據(jù)分子對接一致性評價結果與氫鍵數(shù)顯示，與硝酸甘油（陽性對照） 相比，3 種冰片配體分子均與CHD 重要靶點MMP3、PPARG 結合較優(yōu)，而左旋龍腦與CYP2C9，右旋龍腦、異龍腦與HMGCR、NOS3、ESR1 結合較好；提示ESR1、HMGCR、MMP3、PPARG、CYP2C9、NOS3 可能為3 種冰片作用于CHD 發(fā)揮療效的差異靶點（用于GO 與KEGG 分析）。3 種冰片配體分子與CHD 重要靶點對接的一致性評價結果見表2，構象氫鍵數(shù)見表3，3 種冰片配體分子與MMP3、PPARG 晶體對接構象見圖2～3。

表2 3 種冰片配體分子與重要靶點的一致性的得分

表3 3 種冰片配體分子與重要靶點對接構象的氫鍵數(shù)

2.3 GO 富集分析 對共同重要靶點進行GO 富集分析，前10 條分子功能（P＜0.001） 主要與細胞對含氧化合物的反應、對化學刺激的反應、過渡金屬離子的結合、調(diào)節(jié)平滑肌細胞的增殖、調(diào)節(jié)細胞死亡、單個有機體代謝過程、化學反應、活性氧代謝過程、氧化還原過程、對外界刺激的負調(diào)節(jié)相關。相關GO 分析結果如表4 所示。

圖2 3 種冰片配體分子與MMP3 對接構象圖

圖3 3 種冰片配體分子與PPARG 對接構象圖

2.4 KEGG 富集分析 通過David 6.8 與KOBAS 3.0 對共同重要靶點進行KEGG 富集分析，結果共篩選出38 條通路，其中13 條通路P＜0.01，分別為雌激素信號通路、AMPK 信號通路、癌癥轉錄失調(diào)、代謝途徑、精氨酸生物合成、萜類化合物生物合成、亞油酸的新陳代謝、甲狀腺癌、精氨酸和脯氨酸代謝、VEGF 信號通路、花生四烯酸代謝、視黃醇的新陳代謝、內(nèi)分泌和其他因素調(diào)節(jié)鈣的再吸收，其中前4 條信號通路P＜0.001，提示其可能是3 種冰片調(diào)節(jié)CHD 最為重要的途徑。KEGG 分析結果如表5。

表4 3 種冰片治療CHD 重要靶點的GO 分析

表5 3 種冰片治療CHD 重要靶點的KEGG 分析

3 討論

網(wǎng)絡藥理學可從整體角度探索藥物與疾病的關聯(lián)性，該技術所具系統(tǒng)性、整體性，與中醫(yī)藥整體觀理論，中藥多組分、多靶點特點相似，已廣泛用于中醫(yī)藥領域的相關研究［12-13］。而分子對接是一種計算機輔助藥物設計技術，該技術按照幾何互補、能量互補及化學環(huán)境互補原則評價配體與受體結合效果［14］。本研究所用工具LigandFit 是應用精確的經(jīng)典分子對接方法進行虛擬篩選，其包含8 種不同算法的打分函數(shù)，還能對所有打分函數(shù)評分結果進行綜合評價，使結果較為可靠。雖然網(wǎng)絡藥理學與分子對接技術已成為研究藥物有效性和科學性的新方法，但其亦存在一些問題［15-16］。如相關數(shù)據(jù)庫建設的完整性，網(wǎng)絡分析方法的建立，靶點蛋白及其晶體結構、陽性化合物的選擇，分子處理等過程能直接影響所預測的生物標志物及其作用機制的準確性，出現(xiàn)“假陽性” 結果。因此對研究結果還需進一步驗證［17-18］。

網(wǎng)絡藥理學與分子對接結果提示ESR1、HMGCR、MMP3、PPARG、CYP2C9、NOS3 可能為3 種冰片作用于CHD 發(fā)揮療效的差異靶點，其中3 種冰片配體分子均與MMP3、PPARG 結合較好，提示這2 個靶點可能均為3 種冰片治療CHD 的重要潛在靶點。現(xiàn)代藥理研究表明基質金屬蛋白酶能降解細胞外基質幾乎所有成分，引起血管平滑肌細胞遷移和增殖，對動脈粥樣硬化（AS） 過程發(fā)揮重要作用［19］。其亦能降低斑塊穩(wěn)定性，導致急性心肌梗死、不穩(wěn)定性心絞痛等急性冠狀動脈綜合征（ACS） 的發(fā)生［20］。對PPARG 的現(xiàn)代藥理研究證明其在葡萄糖和脂質代謝中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，亦可對心血管系統(tǒng)產(chǎn)生影響［21］。楊海燕等［22］測定健康成年及老年人AS 患者血清PPARγ基因的表達，結果PPARγ基因表達與AS 嚴重程度呈正相關。綜上，MMP3、PPARγ 與CHD 進程相關，可能為三種冰片調(diào)控CHD 的潛在重要靶點。

CHD 是一類嚴重危害人們生命健康，影響人們生活水平的疾病。其發(fā)病因素復雜，與吸煙、肥胖、高血壓、高血脂、炎癥、性別、年齡等因素密切相關［23］。本研究對與3 種冰片結合較好的共同重要靶點進行GO 與KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)，3 種冰片可通過調(diào)節(jié)細胞增殖、代謝、死亡等多個生物學過程及調(diào)控機體內(nèi)分泌、物質代謝、信號轉導等多條通路改善CHD 病理狀態(tài)。所預測的潛在重要信號通路中雌激素信號通路、AMPK 信號通路、癌癥轉錄失調(diào)、代謝途徑可能為3 種冰片調(diào)節(jié)CHD 的最為重要的途徑。

查閱文獻發(fā)現(xiàn)，雌激素可通過“核啟動類固醇信號”和“膜啟動類固醇信號” 2 條通路調(diào)節(jié)細胞行為，相關受體被激活后，可迅速激活Ca2+、cAMP、PI3K-Akt、蛋白激酶級聯(lián)等信號通路，發(fā)揮心血管保護作用，其作用機制與調(diào)節(jié)血管舒張、抗心肌細胞凋亡、刺激新血管形成等過程相關［24］。AMPK （磷酸腺苷活化蛋白激酶） 作為細胞能量代謝的關鍵因子，在缺血缺氧等能量缺乏情況下，可調(diào)節(jié)正反向相關因子調(diào)控細胞自噬、凋亡、炎癥反應等過程發(fā)揮抗心血管損傷作用［25］。一氧化氮（NO） 具有擴張血管，增加血流量的作用，而精氨酸作為NO 的前體，可以協(xié)助舒張血管［26］。羥脯氨酸（HP） 可由脯氨酸羥化而來，在膠原蛋白中含有量最多；急性心肌梗塞后心肌細胞外基質的主要變化是膠原沉積和纖維化，有研究表明急性心肌梗塞后梗塞區(qū)HP 含有量明顯增加，提示梗塞區(qū)有膠原纖維的沉積，HP 參與了心肌梗塞進程［27］。報道萜類化合物具有重要的生理活性，而冰片主要成分龍腦是一種雙環(huán)單萜類成分，天然冰片又含律草烯、石竹烯等倍半萜，以及麥珠子酸、龍腦香醇、古柯二醇等三萜化合物［28］；現(xiàn)代藥理研究表明單味冰片能減輕犬急性心肌缺血引起的心肌損傷［29］；亦有研究表明三萜類化合物可通過調(diào)節(jié)血糖濃度，降低血脂和血壓等途徑調(diào)節(jié)心血管疾?。?0］。亞油酸能夠降低血清膽固醇水平，抑制動脈血栓的形成，可用于臨床預防、控制、治療動脈粥樣硬化以及心肌梗塞等心腦血管疾病［31］。視黃酸（RA） 是維生素A （視黃醇） 的衍生物，對心血管發(fā)育過程發(fā)揮著基本的調(diào)節(jié)作用［32］?；ㄉ南┧岽x是主要的炎癥途徑，當致炎因子入侵細胞時，磷脂酶A2 （PLA2） 催化磷脂，發(fā)生花生四烯酸（AA） 炎癥級聯(lián)代謝反應［33］。VEGF 為一種促內(nèi)皮細胞分裂素，與血管新生血管密切相關，在體內(nèi)外均能促進內(nèi)皮細胞分裂、增殖和血管形成，在心血管疾病方面發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用［34］。綜上，此研究結果體現(xiàn)了中藥多靶點、多途徑發(fā)揮療效的特點，以期為3 種冰片調(diào)控CHD 的作用機制提供了參考。