陳韻之，田 蕾

（1.錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，遼寧 錦州121000； 2.錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，遼寧 錦州121000）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC） 是常見的慢性非特異性結(jié)腸炎癥，病因復雜，發(fā)病機制尚未完全明了［1］?，F(xiàn)已有文獻指出，氧化損傷、遺傳、環(huán)境、免疫、感染以及精神狀態(tài)等因素在UC 的發(fā)生發(fā)展中均發(fā)揮著一定的影響作用［2］。隨著近年來UC 發(fā)病機制研究的不斷深入，多種因素共同作用這一解釋逐漸得到詮釋，其中，氧化損傷反應(yīng)在UC 發(fā)生發(fā)展中的作用也逐漸受到臨床研究人員的重視。有研究指出，環(huán)氧化酶-2 （cyclooxyenase-2，COX-2） 是一類與結(jié)腸癌發(fā)生密切相關(guān)的炎癥因子，不僅與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，在機體的炎癥反應(yīng)中，也扮演著重要角色［3］。誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS） 是一種重要的炎性介質(zhì)，在機體炎癥的發(fā)生過程中發(fā)揮著舉足輕重的作用，其在被激活后，可明顯加重機體腸黏膜的炎性損傷程度和范圍，且其在機體組織內(nèi)水平與機體黏膜組織的炎癥程度以及炎癥范圍呈明顯的正相關(guān)關(guān)系［4］。本研究擬通過比較秦皮甲素對UC 小鼠結(jié)腸組織中COX-2 和iNOS 表達影響，探究秦皮甲素對UC 的作用。

1 材料

1.1 動物 BALB／c 雄性小鼠90 只，體質(zhì)量21～24 g，購于遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司（生產(chǎn)許可證號SCXK（遼）2015-0001）。飼養(yǎng)室溫度23～25 ℃，相對濕度55%～65%，12 h 明暗交替，基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，自由飲食飲水。

1.2 藥物與試劑 秦皮甲素（純度≥980 mg／g，陜西柏科生物科技有限公司）；葡聚糖硫酸鈉（DSS，大連美侖生物科技有限公司）；柳氮磺胺吡啶（SASP，武漢遠成共創(chuàng)科技有限公司）；全蛋白提取試劑盒、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE 凝膠快速制備試劑盒、羊抗兔IgG-HRP（沈陽萬類生物科技有限公司）；PVDF 膜（美國Millipore公司）；蘇木精、DAB 顯色液、山羊血清（北京索萊寶科技有限公司）；COX-2 抗體、iNOS 抗體、Nrf2 抗體（沈陽萬類生物科技有限公司）。

1.3 儀器 石蠟切片機（德國Leica 公司）；顯微鏡拍照系統(tǒng)sc-180 （日本Olumpus 公司）；HRP 標記山羊抗兔IgG（美國Thermo Fisher 公司）。

2 方法

2.1 造模及分組 90 只BALB／c 雄性小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。造模前均禁食24 h，采用隨機數(shù)字表法隨機分為正常組、模型組、柳氮磺胺吡啶組及秦皮甲素低、中、高劑量組，每組15 只。參照文獻［6］ 造模，除正常組自由飲水外，各組大鼠經(jīng)飲水途徑給予2.5 %DSS，連續(xù)7 d，結(jié)束DSS 干預(yù)后用正常飲水替代DSS 飼養(yǎng)2 周；柳氮磺胺吡啶組小鼠給予柳氮磺胺吡啶（200 mg／kg） 灌胃，秦皮甲素低、中、高劑量組小鼠分別給予75、150、300 mg／kg 秦皮甲素灌胃，正常組和模型組采用生理鹽水（20 mL／kg） 灌胃，給藥3 周。

2.2 取材 給藥3 周后，取小鼠的結(jié)腸組織，對其腸組織進行蛋白質(zhì)的提取。剪取結(jié)腸病變最明顯處置于4%甲醛溶液中進行固定，酒精脫水，石蠟包埋，切片，蘇木素-伊紅（HE） 染色和免疫組化（ICH）。

2.3 疾病活動指數(shù)（DAI） 評分 根據(jù)小鼠日常狀態(tài)評分，包括大便性狀、大便隱血、體質(zhì)量下降等3 個方面的內(nèi)容，具體評分標準為大便性狀及顏色均正常，大便隱血實驗陰性，體質(zhì)量未見減輕為0 分；大便性狀及顏色正常，大便隱血陰性，體質(zhì)量下降約1%～5% 為1 分；大便松散不成形，大便隱血呈陽性反應(yīng)，體質(zhì)量減輕約5%～10%為2 分；大便松散不成形，大便隱血實驗呈陽性，體質(zhì)量減輕約10%～15%為3 分；大便細軟不成形，可見肉眼血便，體質(zhì)量減輕＞15% 為4 分［7］。DAI 值為3 個方面內(nèi)容總分的均值，DAI＝ （體質(zhì)量指數(shù)+大便形狀+出血情況） ／3。

2.4 COX-2、iNOS、Nrf2 表達 采用Western blot 法檢測小鼠結(jié)腸組織中COX-2、iNOS、Nrf2 蛋白表達，所有的操作方法均按照文獻及試劑盒說明書操作檢測。

2.5 HE 染色及組織學損傷指數(shù)（TDI） 評分 根據(jù)小鼠病變組織HE 染色評分，包括炎癥、病變深度、隱窩破壞、病變范圍4 個方面的內(nèi)容，具體評分標準為黏膜完整，未見明顯炎癥反應(yīng)，病變范圍約1%～25 %為0 分；可見黏膜輕度炎癥，但僅局限于黏膜下層，約有1／3 基底隱窩破壞，病變范圍26%～50% 為1 分；黏膜可見重度炎癥，病變深及肌層，約有2／3 基底隱窩破壞，病變范圍51%～75%為2分；病變深及漿膜層，表面上皮僅完整可見，病變范圍76%～100%為3 分；炎癥反應(yīng)較重，未見完整黏膜，全部隱窩和上皮均被破壞為4 分［8］。TDI 值為4 個方面內(nèi)容總分的均值，DAI ＝ （炎癥+病變深度+隱窩破壞+病變范圍）／4。

2.6 免疫組化 所有組織切片均在普通光鏡下盲法讀片，以細胞胞質(zhì)、部分胞核、胞膜出現(xiàn)棕黃色或棕色顆粒為COX-2、iNOS 表達陽性，以無棕黃色出現(xiàn)為COX-2、iNOS表達陰性。

2.7 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 19.0 軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以（） 表示；多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以P≤0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠DAI 評分 與正常組比較，模型組小鼠DAI評分偏高（P＜0.05），且柳氮磺胺吡啶組小鼠DAI 評分也升高（P＜0.05）。與模型組比較，秦皮甲素低、中、高劑量組小鼠DAI 評分降低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠DAI 評分比較（， n＝15）

表1 各組小鼠DAI 評分比較（， n＝15）

注：與正常組比較，?P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

3.2 各組小鼠腸組織COX-2、iNOS 蛋白表達 與正常組比較，模型組COX-2、iNOS 蛋白表達上調(diào)，而秦皮甲素干預(yù)后，COX-2、iNOS 蛋白表達下調(diào)，見圖1～2。后續(xù)實驗，選用秦皮甲素中劑量組與柳氮磺胺吡啶組進行實驗。

圖1 Western blot 檢測各組小鼠腸組織COX-2 表達

圖2 Western blot 檢測各組小鼠腸組織iNOS 表達

3.3 各組小鼠腸黏膜損傷 HE 染色結(jié)果顯示，正常組小鼠腸黏膜形態(tài)正常，未見明顯異常；模型組小鼠腸黏膜出現(xiàn)不同程度壞死或脫落表現(xiàn)，伴有不同程度充血、水腫及潰瘍表現(xiàn)，黏膜層及黏膜下層可見大量淋巴細胞、中性粒細胞等炎癥細胞浸潤，部分切片有纖維組織增生表現(xiàn)；柳氮磺胺吡啶組、秦皮甲素中劑量組小鼠腸黏膜可見輕度水腫及潰瘍表現(xiàn)，且柳氮磺胺吡啶組小鼠與秦皮甲素中劑量組小鼠腸黏膜水腫及潰瘍表現(xiàn)相近見圖3。

圖3 各組小鼠腸黏膜HE 染色

3.4 各組小鼠TDI 評分 與正常組比較，模型組小鼠TDI評分增高（P＜0.05），與模型組比較，柳氮磺胺吡啶組和秦皮甲素中劑量組小鼠的TDI 評分降低（P＜0.05）。見表2。

表2 各組小鼠TDI 評分比較（， n＝15）

表2 各組小鼠TDI 評分比較（， n＝15）

注：與正常組比較，?P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

3.5 各組小鼠腸組織COX-2 和iNOS 表達 COX-2 在正常組UC 小鼠腸組織中幾乎不表達；COX-2 在模型組UC 小鼠腸組織中呈陽性表達，血管內(nèi)皮細胞、結(jié)締組織細胞、淋巴細胞、巨噬細胞及上皮細胞中均可見COX-2 表達增加，細胞胞核及胞質(zhì)呈陽性表達；COX-2 在柳氮磺胺吡啶組及秦皮甲素中劑量組UC 小鼠腸組織中則呈弱陽性表達，上皮細胞、血管內(nèi)皮細胞及結(jié)締組織細胞等細胞胞核及胞質(zhì)呈弱陽性表達見圖4。

iNOS 在正常組UC 小鼠腸組織中不表達；iNOS 在模型組UC 小鼠腸組織中表達增強，在淋巴細胞、巨噬細胞等炎性細胞，以及上皮細胞、血管內(nèi)皮細胞及結(jié)締組織細胞等細胞中，胞核及胞質(zhì)呈陽性表達；iNOS 在柳氮磺胺吡啶組及秦皮甲素中劑量組UC 小鼠腸組織中則成弱陽性表達見圖5。

3.6 各組小鼠腸組織Nrf2 蛋白表達 與正常組比較，模型組小鼠UC 大腸組織中Nrf2 蛋白高表達（P＜0.05），與模型組比較，柳氮磺胺吡啶組及秦皮甲素中劑量組小鼠組織中Nrf2 蛋白水平進一步增高（P＜0.05），見表3、圖6。

表3 各組小鼠組織Nrf2 蛋白表達比較（， n＝15）

表3 各組小鼠組織Nrf2 蛋白表達比較（， n＝15）

注：與正常組比較，?P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

4 討論

UC 是一種以慢性反復發(fā)作為特征的非特異性結(jié)腸炎癥，受累部位主要為乙狀結(jié)腸以及直腸，常累積黏膜及黏膜下層，其發(fā)病機制至今仍未明確［9-10］。目前認為，UC 的發(fā)生發(fā)展與多種因素的作用均有一定關(guān)聯(lián)，例如感染、氧化損傷反應(yīng)、環(huán)境、遺傳以及免疫等多種因素。其中，由氧化損傷介導的免疫失衡及炎癥反應(yīng)，是UC 發(fā)生發(fā)展的重要促進因素［11-12］。

COX-2 是機體缺氧調(diào)控因子的重要靶基因產(chǎn)物，在機體細胞凋亡的調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，同時還參與機體血管再生的靶向調(diào)節(jié)，在機體炎癥反應(yīng)以及腫瘤發(fā)生的過程中，均扮演著重要角色［13-14］。iNOS 則是一種主要表達于炎癥細胞中的蛋白非依賴性酶，是誘導NO 生產(chǎn)關(guān)鍵酶的重要因子［15-16］。研究表明，Nrf2／COX-2 信號通路是機體重要的抗炎信號通路之一，同時也是機體重要的抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)之一，相關(guān)抗氧化基因表達的激活，能有效啟動Nrf2 的抗氧化反應(yīng)和排異反應(yīng)，從而通過促進Nrf2 的高表達，形成對黏膜組織的保護作用［17-18］。本研究結(jié)果顯示，柳氮磺胺吡啶和秦皮甲素均可有效改善DSS 誘導的UC 小鼠的腸組織炎癥狀態(tài)，改善小鼠腸黏膜的水腫狀態(tài)，同時明顯緩解小鼠腸黏膜的充血狀態(tài)，提高小鼠腸黏膜的DAI 評分以及TDI 評分水平。在進一步的作用機制探究中，中劑量秦皮甲素能通過下調(diào)UC 小鼠腸黏膜中COX-2、iNOS 的表達，上調(diào)反向Nrf2 的表達水平，從而有效減輕小鼠的腸黏膜炎癥狀態(tài)，發(fā)揮抗炎抗氧化的作用。

圖4 免疫組化檢測各組小鼠腸黏膜COX-2 表達

圖5 免疫組化檢測各組小鼠腸黏膜iNOS 表達

圖6 Western blot 檢測各組小鼠組織Nrf2 蛋白表達

綜上所述，秦皮甲素對DSS 誘導的UC 小鼠具有良好的治療作用，可通過下調(diào)小鼠腸黏膜組織中COX-2、iNOS的表達，改善Nrf2 水平，發(fā)揮拮抗UC 小鼠腸黏膜炎癥的作用。