繆 萍，周 飛，王邦才，張 斌

（1.寧波市鄞州人民醫(yī)院，浙江 寧波315040； 2.寧波大學醫(yī)學院，浙江 寧波315211； 3.寧波市中醫(yī)院，浙江 寧波315010）

代謝綜合征（metabolic syndrome，MS） 是以中心性（腹型） 肥胖、高血壓、血脂異常、糖尿病或糖耐量受損等多種代謝性疾病聚集出現(xiàn)為特點的一組臨床癥候群［1］，以胰島素抵抗（insulin resistance，IR） 為共同病理基礎(chǔ)［2］，已成為全球公共健康主要問題。腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK） 是一種細胞和機體的“能量調(diào)節(jié)器”，被激活的AMPK 有助于糾正代謝紊亂，使之趨向生理平衡，成為治療多種代謝性疾病的新靶點［3］。白藜蘆醇（resveratrol，Res） 是一種非黃酮類多酚化合物，廣泛分布于虎杖、葡萄、花生等多種植物中，具有降脂、保肝、抗炎、抗氧化及調(diào)節(jié)免疫等藥理活性［4］。本研究擬采用高脂高鹽高糖飲食誘導大鼠MS 模型，圍繞AMPK 信號傳導通路的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，探討白藜蘆醇改善糖脂代謝的可能作用機制。

1 材料

1.1 動 物 SPF級雄性SD大鼠32只，體質(zhì)量（200±20） g，購自浙江省醫(yī)學科學院實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號SCXK （浙） 2014-0001，飼養(yǎng)于寧波大學實驗動物中心，自由進食飲水。

1.2 藥物與試劑 白藜蘆醇 （純度為99.88%，批號FY10700805） 購自江蘇南通飛宇生物科技有限公司，用純水配制成質(zhì)量濃度為20 mg／mL 的混懸液；鹽酸二甲雙胍片（國藥準字H20023370） 購自中美上海施貴寶制藥有限分司，使用前用蒸餾水配成質(zhì)量濃度為30 mg／mL 的溶液，以上藥液均置于4 ℃冰箱保存。高脂高鹽高糖飼料購自北京科澳協(xié) 力飼料 有限公 司；空腹血 糖 （FPG，批 號151041-01）、空腹胰島素（FINS，批號21587103）、總膽固醇 （TC，批 號 2175701）、甘油三 酯 （TG，批 號22259201）、高密度脂蛋白（HDL-C，批號621827-01）、低密度脂蛋白（LDL-C，批號618989-01） 試劑盒購自瑞士羅氏公司；RNA 抽提試劑盒（批號1701G14） 購自上海捷瑞生物工程有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號7E092G6）、熒光定量PCR 試劑盒（批號7E092H6） 均購自南京諾唯贊生物科技有限公司；引物由上海桑尼生物科技有限公司合成；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（增強型，批號P0010S）、RIPA裂解液（批號P0013B） 均購自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所；乙酰輔酶A 羧化酶（ACC，批號4190S） 抗體購自美國CST 公司；脂肪酸合成酶（Fas，批號SC1023） 抗體購自美國Santa 公司。

1.3 儀器 BW-NIBP1106 型無創(chuàng)血壓測量系統(tǒng)（上海軟隆科技發(fā)展有限公司）；C501 全自動生化分析儀（瑞士羅氏公司）；SMA 4000 微量紫外分光光度計（美國Merinton公司）；SCIENTZ-48 高通量組織研磨器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；Spectra Max Plus 384 酶標儀 （美國Molecular Devices 公司）；CFX connect 熒光定量PCR 儀、Mini-Proten Tetra System 電泳系統(tǒng)、ChemiDoc XRS 凝膠成像系統(tǒng)均購自美國Bio-Rad 公司；Avanti J-E多用途高效離心機（美國Beckman 公司）；XS-105電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；超低溫冰箱（美國Thermo 公司）。

2 方法

2.1 造模 采用高脂高鹽高糖飼料（基礎(chǔ)飼料56%+豬油15%+蔗糖15%+蛋黃10% +食鹽2% +膽固醇2%） 喂養(yǎng)16周建立MS 模型。

2.2 分組、給藥 大鼠適應性飼養(yǎng)7 d 后，按隨機數(shù)字表法分為正常組、模型組、白藜蘆醇組、二甲雙胍組，每組8 只。參考文獻 ［5］，制定白 藜蘆醇 給藥劑量為100 mg／kg，二甲雙胍根據(jù)成人臨床日用量，按體表面積折算動物有效劑量，給藥劑量為150 mg／kg，正常組和模型組給予蒸餾水，給藥體積為5 mL／kg，1 次／d，連續(xù)4 周。每天觀察大鼠的一般情況（精神狀態(tài)、活動、進食量和皮毛等），每周測定體質(zhì)量。

2.3 取樣 末次給藥后，禁食不禁水12 h，腹腔注射25%烏拉坦（4 mL／kg） 麻醉，腹主動脈取血，3 000 r／min離心20 min，分離血清，-70 ℃保存?zhèn)溆谩７蛛x腸系膜、雙側(cè)附睪旁和腎周脂肪組織，預冷生理鹽水洗凈，濾紙吸干，稱定質(zhì)量，并記錄。剪取肝臟左葉相同部位組織，-70 ℃凍存待檢。計算體脂比＝ （腹腔脂肪質(zhì)量／體質(zhì)量） ×100%。

2.4 血壓測定 大鼠安靜狀態(tài)下監(jiān)測尾動脈血壓，平行測量3 次，取平均 值，記錄收縮壓 （SBP） 和舒張 壓（DBP），每周測量1 次。

2.5 血清指標檢測 按試劑盒說明書檢測血清FPG、FINS、TC、TG、HDL-C、LDL-C 水平。計算胰島素抵抗指數(shù) （HOMA-IR） ＝ ［FPG （mmol／L） × FINS （mIU／L）］ ／22.5。

2.6 qRT-PCR 法檢測肝 臟AMPKα、ChREBP、SREBP-1 mRNA 表達 TRIzol 法提取總RNA。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應條 件為50 ℃、15 min，85 ℃、2 min。引物序 列，AMPKα正 向 5′-CAA CAAGCCCACCCGATTC-3′，反 向5′-TGC CACTTTGCCTTCCGT-3′，163 bp；ChREBP正 向5′-GCAACTGAGGGATGA AATAGAGG-3′，反向5′-TCAAA TAAAGGTCGGATGAGGA-3′ （R），195 bp；SREBP-1 正向5′-TTGAGGATAACCAGGTGAAAGC-3′，反向5′-TCAGAGGGAGTG AGGATGCC -3′，154 bp；β-actin正向5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′，反向5′-TCAGAG GGAGTGAGGATGCC-3′，150 bp。擴增反應程序為95 ℃、30 s，95 ℃、10 s，60 ℃、30 s，40 個循環(huán)。結(jié)束后進入融解曲線采集程序，從70 ℃開始每5 s 將溫度提高0.5 ℃并采集熒光信號，直至溫度達到95 ℃。以β-actin為內(nèi)參，采用Livak（2-△△ct） 法進行相對基因表達分析。

2.7 Western blot 法檢測肝臟ACCα、Fas 蛋白表達 用RIPA 裂解液提取肝臟組織蛋白，BCA 法測定蛋白濃度。取30 μg 樣品，SDS-PAGE 電泳，PVDF 轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗（1 ∶1 000） 4 ℃孵育過夜，TBST 緩沖液搖床洗膜后加二抗（1 ∶5 000），室溫孵育1 h，TBST緩沖液反復洗后，ECL 發(fā)光顯色，凝膠成像儀曝光成像。Image J 軟件分析條帶灰度值，并進行半定量分析處理。

2.8 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)以（） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠一般狀態(tài) 正常組活動敏捷、反應靈敏、毛發(fā)光澤、體質(zhì)量逐漸增加、大便呈顆粒狀，模型組動作遲緩、反應遲鈍、皮毛蓬亂、光澤度變差、后期出現(xiàn)脫毛、大便質(zhì)軟、飲水量增多、體質(zhì)量增加（P＜0.01）、腹腔脂肪堆積（P＜0.01）、體脂比升高（P＜0.01）。給藥組狀態(tài)較模型組有所改善，體質(zhì)量、腹腔脂肪質(zhì)量及體脂比均下降（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量、腹腔脂肪質(zhì)量及體脂比比較（， n＝8）

表1 各組大鼠體質(zhì)量、腹腔脂肪質(zhì)量及體脂比比較（， n＝8）

注：與正常組比較，??P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05。

3.2 大鼠血壓 與正常組比較，模型組大鼠血壓SBP、DBP 升高（P＜0.01）；與模型組比較，白藜蘆醇、二甲雙胍均能降低SBP、DBP （P＜0.05，P＜0.01）。見表2。

3.3 大鼠血糖及胰島素 與正常組比較，模型組大鼠血清FPG、FINS 水平及HOMA-IR 升高（P＜0.01），與模型組比較，白藜蘆醇組、二甲雙胍組上述指標均降低（P＜0.01）。見表3。

3.4 大鼠血脂 與正常組比較，模型組大鼠血清TC、LDL-C 水平升 高，而 HDL-C 水平降 低 （P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，白藜蘆醇在一定程度上改善脂質(zhì)異常，主要是降低LDL-C 水平，提高HDL-C 水平（P＜0.05），但對TC 影響不大。見表4。

表2 各組大鼠血壓比較（1 mmHg＝0.133 kPa，， n＝8）

表2 各組大鼠血壓比較（1 mmHg＝0.133 kPa，， n＝8）

注： 與正常 組比較，?? P ＜ 0.01；與模型 組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

3.5 大鼠肝 臟AMPKα、ChREBP、SREBP-1 mRNA 表達 與正常組相比，模型組大鼠肝組織AMPKαmRNA 表達降低 （P＜0.01），ChREBP、SREBP-1 mRNA 表達增 加（P＜0.01）；與模型組比較，白藜蘆醇組、二甲雙胍組均能上調(diào)AMPKαmRNA 表 達 （P＜0.05，P＜0.01），降 低ChREBP、SREBP-1 mRNA 表達（P＜0.01）。見圖1。

表3 各組大鼠血糖及胰島素水平比較（， n＝8）

表3 各組大鼠血糖及胰島素水平比較（， n＝8）

注：與正常組比較，??P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01；與白藜蘆醇組比較，#P＜0.05。

表4 各組大鼠血脂水平比較（mmol／L，， n＝8）

表4 各組大鼠血脂水平比較（mmol／L，， n＝8）

注：與正常組比較，?P＜0.05，??P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05。

圖1 各組大鼠肝組織AMPKα、 ChREBP、 SREBP-1 mRNA 表達比較（n＝5）

3.6 大鼠肝臟ACCα、Fas 蛋白表達 與正常組比較，模型組大鼠肝臟ACCα、Fas 蛋白表達升高（P＜0.01）；與模型組比較，白藜蘆醇組、二甲雙胍組均能抑制ACCα、Fas蛋白表達（P＜0.05）。見圖2。

4 討論

圖2 各組大鼠肝組織ACCα、Fas 蛋白表達比較（n＝8）

本實驗采用高脂高鹽高糖飼料喂養(yǎng)構(gòu)建MS 模型，旨在模擬人類營養(yǎng)性肥胖代謝紊亂的自然病理過程。研究結(jié)果提示，該模型具有腹型肥胖、高血壓、血糖血脂異常、高胰島素血癥等特征。經(jīng)白藜蘆醇干預后，能有效控制體質(zhì)量和血壓，明顯降 低血清FBG、FINS、HOMA-IR、LDL-C水平，提高HDL-C 水平，改善IR，使機體的糖脂代謝趨于正常。

MS 的發(fā)病涉及IR、糖脂代謝、氧化應激和炎癥反應等多個機制，且各機制之間相互影響、相互促進。近年來研究［3］表明，AMPK 信號通路轉(zhuǎn)導異常引起糖脂代謝紊亂是MS 發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。AMPK 是一種高度保守的絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶，由催化亞單位α 和調(diào)節(jié)亞單位β、γ 組成，廣泛存在于骨骼肌、肝臟、胰腺和脂肪組織中。其最主要的生物學效應是通過感受胞漿內(nèi)AMP／ATP 比值的變化進行調(diào)節(jié)，控制產(chǎn)能的分解與合成代謝通路，保證細胞能量的供應。國外學者研究［6］證實，在食物攝入量相同的情況下，與正常組相比，AMPKα2 基因敲除小鼠的體質(zhì)量和脂肪組織含有量均增加。當應激反應（如局部缺氧缺血、運動、饑餓和熱休克等） 發(fā)生時，細胞感受到能量危機，通過ATP 產(chǎn)生減少或利用增加，使細胞內(nèi)AMP／ATP 的比值上升，從而激活AMPK。被活化的AMPK 通過多條信號通路對機體糖脂代謝發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，主要通過磷酸化抑制ACC 活性，從而抑制脂肪酸的合成，并增強線粒體對脂肪酸的利用和氧化［7］；同時激活的AMPK作為SREBP-1 的上游激酶，可抑制其轉(zhuǎn)錄，阻斷脂肪酸和TG 合成相關(guān)酶的表達［8］；誘導葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白（GLUT-4）表達，促進外周組織葡萄糖的攝取，增加胰島素敏感性［9］。

SREBPs 是調(diào)控脂質(zhì)合成的重要轉(zhuǎn)錄因子家族［10］，它有3 種形式的異構(gòu)體（SREBP-1a、SREBP-1c、SREBP-2）。其中SREBP-1 主要參與脂肪酸和TG 的合成，能夠促進脂肪酸從頭合成途徑中的關(guān)鍵酶ACCα、Fas 的表達。若SREBP-1 過度表達，將導致脂質(zhì)在肝臟、血管和胰島等非脂肪組織中異常積聚，從而誘發(fā)肥胖、2 型糖尿病和脂肪肝等代謝類疾?。?1］。ChREBP 是堿性螺旋-環(huán)-螺旋-亮氨酸拉鏈（bHLH／ZIP） 轉(zhuǎn)錄因子Mondo 家族成員［12］，它的靶標主要是與糖酵解、糖異生和脂質(zhì)生成相關(guān)的酶類，包括肝丙酮酸激酶（LPK）、磷酸果糖激酶 （PFK）、ACC 和Fas 等，在機體脂質(zhì)代謝和葡萄糖穩(wěn)態(tài)的調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用。SREBP-1 和ChREBP 協(xié)同發(fā)揮作用，調(diào)節(jié)脂質(zhì)合成相關(guān)酶（如ACC、Fas、SCD1） 的表達。

研究［13］發(fā)現(xiàn)，針對AMPK 靶點的藥物有助于MS 的預防和治療。臨床上常用的二甲雙胍是AMPK 激活劑［14］，可改善2 型糖尿病KKAy 小鼠糖耐量異常，促進胰島β 細胞分泌，減輕肝臟脂肪沉積［15-16］。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，白藜蘆醇同樣能明顯提高MS 大鼠肝臟AMPKα 活性，降低下游靶分子ChREBP、SREBP-1 mRNA 和ACCα、Fas 的蛋白表達，進而改善脂質(zhì)和糖代謝失衡，延緩MS 的發(fā)展進程。