尤文挺，江 天，王 灑，何 龍，楊詩奕，李云岳

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬溫嶺醫(yī)院，浙江 溫嶺317500； 2.臺州市腫瘤醫(yī)院，浙江 溫嶺317500； 3.溫嶺市茗果高橙專業(yè)合作社，浙江 溫嶺317500）

溫嶺高橙是浙江省溫嶺市傳統(tǒng)的柑橘類品種，早在明代嘉靖《太平縣志》 中就有其種植的記載，其栽培歷史至少有470 年以上，我國著名園藝學(xué)家吳耕民教授曾專門考證并推定它為葡萄柚原生種［1］。溫嶺高橙果實風(fēng)味獨特、酸甜適中、略帶苦味，當?shù)厝苏J為它具有清熱降火、醒酒護肝等功效，深受該市及周邊地區(qū)消費者的喜愛［2］，但在日常食用過程中其果皮和種子往往被丟棄，不僅易造成生態(tài)環(huán)境污染，更讓檸檬苦素這種具有潛在藥用價值的生物活性物質(zhì)白白浪費，造成極大的損失。

檸檬苦素是存在于蕓香科、楝科植物中的一類三萜類化合物［3-4］，在柑橘中含有量最高，具有抗癌、抗氧化、抗炎、抗瘧疾、抗病毒、抗菌、神經(jīng)保護、改善骨質(zhì)量等生物活性［5-6］，隨著相關(guān)研究的深入，如何從植物中提取該成分也越來越受研究者的關(guān)注。超聲提取作為一種新技術(shù)，它與傳統(tǒng)溶劑提取相比可利用超聲波產(chǎn)生的攪拌、強烈振動、高加速度、熱效應(yīng)、空化效應(yīng)等作用來有效破壞植物細胞壁，加速細胞內(nèi)活性成分進入提取溶劑，從而提高提取效率，縮短提取時間，節(jié)約溶劑，并且避免高溫對提取成分的破壞［7］。因此，本實驗超聲提取高橙皮中檸檬苦素，并在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用正交試驗對其工藝進行優(yōu)化，以期篩選出一種高效經(jīng)濟的提取方法，為今后相關(guān)工業(yè)化應(yīng)用提供一定的參考。

1 材料

1.1 儀器 DHG-9 423 A 鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；FW-135 植物粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；SK2510HP 超聲波清洗器（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）；E-UEC-200I 超聲波聲強測量儀（杭州成功超聲電源技術(shù)有限公司）；RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、SHZ-Ⅲ真空泵（上海亞榮生化儀器廠）；Waters 2695 HPLC 色譜儀、Waters 2487 紫外檢測器（美國Waters 公司）；DU800 紫外／可見光分光光度計（美國Beckman 公司）；BS110S 電子分析天平 （德國Sartorius 公司）；PHS-3C 型精密PH 計（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）。

1.2 試劑與藥物 新鮮高橙于2015 年12 月由溫嶺國慶塘高橙場、溫嶺塢根茗果高橙專業(yè)合作社提供，丟棄過度成熟和有損壞者，符合要求者通過手工剝皮并切碎，將皮置于45 ℃干燥箱中干燥至恒定質(zhì)量，植物粉碎機粉碎，篩選出40～100 目粒度放入密封樣品袋中，置于干燥器內(nèi)保存?zhèn)溆?。檸檬苦素對照品（美國Sigma-Aldrich 公司）。乙腈為色譜純（德國Merck 公司）；乙醇、二氯甲烷為分析純（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液制備 超聲提取在超聲波清洗器中進行，最大輸入功率為250 W，工作頻率為53 kHz。取高橙皮5.0 g，置于250 mL 錐形瓶中，加入適當體積不同體積分數(shù)的乙醇，懸空置于離底面3 cm 高度的位置，在53 kHz頻率、不同參數(shù)下提取。同時，錐形瓶在超聲波清洗器自帶的溫度控制系統(tǒng)中保持對應(yīng)的恒溫，提取后抽濾，濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無醇味，100 mL 二氯甲烷分3 次萃取，保留并合并二氯甲烷相，45 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，瓶壁殘渣用乙腈定容至10 mL，過0.45 μm 疏水膜，即得。

2.2 對照品溶液制備 精密稱取檸檬苦素對照品10.0 mg，乙腈定容，制成1.0 mg／mL 貯備液，取適量依次稀釋成0.4、0.3、0.2、0.1、0.05、0.025 mg／mL，即得。

2.3 檸檬苦素含有量測定

2.3.1 色譜條件 ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；ZORBAX Eclipse Plus C18保護柱（4.6 mm × 12.5 mm）；流動相乙腈-水，等度洗 脫（45 ∶55）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長210 nm；進樣量10 μL。色譜圖見圖1。

圖1 檸檬苦素HPLC 色譜圖

2.3.2 線性關(guān)系考察 將 “2.2” 項下對照品溶液在“2.3.1” 項色譜條件下平行進樣測定5 次，以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y） 進行回歸，得方程為Y＝7 017 548.627X-7 854.429 （R2＝0.999 992），在0.025～1.0 mg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。另外，該方程檢測限為1.793 μg／mL，定量限為5.435 μg／mL。

2.3.3 精密度試驗 取“2.2” 項下同一對照品溶液，在“2.3.1” 項色譜條件下平行進樣測定6 次，每次10 μL，測得檸檬苦素峰面積RSD 為0.61%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 取“2.2” 項下同一對照品溶液，在“2.2.1” 項色譜條件下每隔4 h 連續(xù)進樣測定6 次，每次10 μL，測得檸檬苦素峰面積RSD 為1.7%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗 取同一批供試品溶液6 份，在“2.2.1” 項下色譜條件進樣測定，每次10 μL，測得檸檬苦素峰面積RSD 為2.3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.6 檸檬苦素提取率測定 精密吸取“2.1” 項下供試品溶液，在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定，計算提取率，公式為提取率（mg／100 g） ＝C×V／M×100，其中C為檸檬苦素含有量（mg／mL），V為定容體積（mL），M為干燥高橙皮質(zhì)量（g），平行3 份，取平均值。

2.4 單因素試驗 固定乙醇體積分數(shù)70%、液料比20 ∶1、提取時間60 min，考察不同功率（150、175、200、225、250 W） 下不同聲強 （0.049 5、0.098 6、0.159 5、0.255 6、0.384 0 W／cm2） 對檸檬苦素提取率的影響；固定聲強0.159 5 W／cm2、液料比20 ∶1、提取時間60 min，考察不同乙醇體積分數(shù)（50%、60%、70%、80%、90%）對該成分提取率的影響；固定聲強0.159 5 W／cm2、乙醇體積分數(shù)70%、提取時間60 min，考察不同液料比（10 ∶1、15 ∶1、20 ∶1、25 ∶1、30 ∶1） 對該成分提取率的影響；固定聲強0.159 5 W／cm2、乙醇體積分數(shù)70%、液料比20 ∶1，考察不同提取時間（30、45、60、75、90 min）對該成分提取率的影響。

2.5 正交試驗 在單因素試驗基礎(chǔ)上，選擇聲強（A）、乙醇體積分數(shù)（B）、液料比（C）、提取時間（D） 作為影響因素，檸檬苦素提取率作為評價指標，采用L9（34） 正交試驗優(yōu)化提取工藝。因素水平見表1，結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表1 因素水平

表2 試驗設(shè)計與結(jié)果（n＝3）

表3 方差分析

由表2 可知，各因素影響程度依次為B＞C＞A＞D，即乙醇體積分數(shù)＞液料比＞聲強＞提取時間；由表3 可知，因素A、B、C有顯著影響 （P＜0.05），最優(yōu)工藝為A2B2C3D3，但由于D無顯著影響（P＞0.05），并考慮到時間和成本，故將其修正為A2B2C3D1，即聲強0.255 6 W／cm2，乙醇體積分數(shù)70%，液料比30 ∶1，提取時間30 min。

2.6 驗證試驗 按“2.5” 項下優(yōu)化工藝進行3 批平行驗證試驗，測得檸檬苦素提取率分別為61.87、59.82、61.01 mg／100 g，平均60.90 mg／100 g，表明工藝合理可行，可大大節(jié)約提取時間。

3 討論

本實驗發(fā)現(xiàn)，50%乙醇超聲提取后高橙干燥皮中微粒會吸附大量提取液而出現(xiàn)膨脹，導(dǎo)致難以過濾，之后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無醇味的提取液在萃取時出現(xiàn)了乳化現(xiàn)象，使得提取液損耗嚴重，從而降低了檸檬苦的提取率。相關(guān)研究表明［8］，造成上述現(xiàn)象的原因是由于在水比例相對較高的提取液中和超聲、加熱環(huán)境下，果皮組織樣品吸水膨脹加劇，果膠提取率顯著增加，而提取液中果膠具有良好的乳化能力；在醇比例較高的提取液中（90%），由于果膠溶于水而難溶于乙醇，高體積分數(shù)乙醇給提取體系帶來的溶解效益越來越小，果膠開始從溶液主體中沉淀下來［9］，附著在高橙皮微粒的表面，阻礙檸檬苦素擴散，導(dǎo)致其提取率急劇下降。因此，合適的乙醇體積分數(shù)對于提取率的提高優(yōu)化至關(guān)重要。

液料比對天然藥物提取過程具有重要影響，由Fick 擴散第二定律推導(dǎo)出的動力學(xué)模型分析可得，液料比較低時，有效成分溶解不充分，溶液過早進入飽和；液料比較高時，有效成分快速溶解，可提高擴散速度［10-11］。在工藝優(yōu)化過程中發(fā)現(xiàn)，相對較小的液料比（10 ∶1） 會導(dǎo)致檸檬苦素在提取液中的含有量相對較高，而與高橙皮細胞液之間的濃度差較小，不利于物質(zhì)擴散，進而降低提取效率；當液料比增加，濃度差擴大時，可加速檸檬苦素擴散，從而提取率得到改善。

本實驗發(fā)現(xiàn)，不同功率下聲強變化對超聲提取高橙皮中檸檬苦素的影響并不占主導(dǎo)地位。一般情況下，超聲波清洗器在功率范圍內(nèi)的聲強條件下通?？僧a(chǎn)生穩(wěn)態(tài)空化作用，加上超聲的攪拌和傳質(zhì)能力［12］，能有效擊破高橙植物細胞壁，加速細胞內(nèi)容物的釋放和提?。?3］，從而增加檸檬苦素提取率。然而，研究中超聲清洗器功率有限，無法觀察到更大聲強對提取的影響，可能制約了聲強因素對提取的影響程度。

綜上所述，本實驗優(yōu)化的高橙皮中超聲提取檸檬苦素工藝經(jīng)濟高效，以期為今后相關(guān)工業(yè)化應(yīng)用提供一定的參考。