閆治攀，李喜香，張 鵬

（甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州730000）

化瘀通絡蠲痹酊是甘肅省中醫(yī)院骨科中藥制劑，由川續(xù)斷、當歸、赤芍、桑枝、威靈仙、桃仁、紅花、木香、蒼術、伸筋草、枳殼、獨活、花椒13 味藥材組成，具有行氣活血、祛瘀止痛功效，主要用于治療氣滯血瘀型膝骨性關節(jié)炎等病變局部疼痛、拘攣、活動受限等癥。經十余年臨床應用，該方組成獨特固定，臨床療效顯著，故欲將其開發(fā)并注冊為醫(yī)院院內制劑，根據(jù)注冊要求，在原配制方法（將處方藥材粉碎，10 倍量70% 乙醇溶液靜置浸提24 h，取上清液） 的基礎上作進一步研究。

2015 年版《中國藥典》 四部酊劑（0120 項下） 的制備方法包括溶解法、稀釋法、浸漬法、滲漉法［1］，其中滲漉法為酊劑工業(yè)生產的常用手段。在實際生產中，處方飲片本身理化性質、制備酊劑輔料溶劑、設備功能均可能對酊劑質量造成影響。本實驗綜合考慮上述因素，在單因素試驗基礎上采用Box-Behnken 響應面法優(yōu)化化瘀通絡蠲痹酊滲漉工藝，以期為該方制備工藝研究提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；AR124CM 電子天平［0.01、0.1 mg，奧豪斯儀器（上海）有限公司］；滲漉設備 （常熟市制藥化工機械總廠）；FW-200高速萬能能粉碎機（北京科偉水興儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 川續(xù)斷（產地四川）、蒼術（產地內蒙古）、獨活（產地湖北）、花椒（產地四川） 購于甘肅金羚集團藥業(yè)有限公司；當歸（產地甘肅）、桑枝（產地江蘇）、木香（產地云南）、枳殼（產地湖南） 購于甘肅康樂藥業(yè)有限公司；赤芍（產地甘肅） 購于甘肅安泰堂中藥飲片有限公司；威靈仙（產地安徽）、桃仁（產地四川）、紅花（產地新疆）、伸筋草（產地湖北） 購于甘肅隴脈藥材有限公司，均經甘肅省藥品檢定研究院宋平順主任藥師鑒定為正品，符合2015 年版《中國藥典》 一部各藥材項下相關規(guī)定。芍藥苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110736-200934）。甲醇（色譜純）、無水乙醇（分析純）購于天津市科密歐化學試劑有限公司；其他試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 芍藥苷含有量測定

2.1.1 對照品溶液制備 精密稱取芍藥苷對照品3.04 mg于10 mL 量瓶中，甲醇溶解并定容，搖勻，作為貯備液，精密量取1 mL 于10 mL 量瓶中，甲醇定容，搖勻，即得。

2.1.2 供試品溶液制備 精密稱取樣品液10 mL，經0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 陰性樣品溶液制備 按處方比例分別取不含赤芍的陰性樣品處方藥，按“2.1.2” 項下方法制備，取10 mL，經0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 方法學考察 參考文獻［2］ 報道的方法。

2.1.4.1 色譜條件 Zorbax SB-C18分析柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相甲醇-水 （30 ∶70）；體積流量1 mL／min；柱溫25 ℃；檢測波長230 nm［3］；進樣量5 μL。色譜圖見圖1。

2.1.4.2 線性關系考察 精密量取“2.1.1” 項下貯備液1 mL 于10 mL 量瓶中，甲醇定容，搖勻，精密吸取1、3、5、9、15、20 μL，在“2.1.4.1” 項色譜條件下進樣測定。以進樣量為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y） 進行回歸，得到方程為Y＝1 943.836 68X+3.036 668 3 （r＝0.999 7），在0.030～0.608 μg 范圍內線性關系良好。

圖1 芍藥苷HPLC 色譜圖

2.1.4.3 精密度試驗 取“2.1.1” 項下同一對照品溶液，在“2.1.4.1” 項色譜條件下進樣測定5 次，測得芍藥苷峰面積RSD 為0.5%，表明儀器精密度良好。

2.1.4.4 穩(wěn)定性試驗 取“2.1.2” 項下供試品溶液，分別于0、3、6、12、24、48、72 h，在“2.1.4.1” 項色譜條件下進樣測定，測得芍藥苷峰面積RSD 為1.54%，表明溶液在72 h 內穩(wěn)定性良好。

2.1.4.5 重復性實驗 取13 組樣品液，按“2.1.2” 項下方法平行制備5 份供試品溶液，在“2.1.4.1” 項色譜條件下進樣測定，測得芍藥苷峰面積RSD 為1.07%，表明該方法重復性良好。

2.1.4.6 加樣回收率試驗 取“2.5” 項下13 號樣品液9份，每份120 mL （含芍藥苷1.25 mg），按80%、100%、120%水平加入對照品溶液，按“2.1.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1.4.1” 項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，芍藥苷平均加樣回收率為99.57%，RSD為2.39%。

2.2 吸水率測定 取3 份酊劑細粉，每份30 g，置于燒杯中，加10 倍量70%乙醇，封口，室溫下靜置24 h，400目尼龍網過濾，稱定細粉吸水后質量，計算吸水率。結果，3 份酊劑細粉濕重分別為100.72、103.89、101.07 g，吸水率 分別為235.73%、246.30%、236.90%，平均239.64%。

2.3 浸泡時間確定 參考文獻［4］ 報道的方法。取5 份酊劑超粗粉，每份30 g，置于燒杯中，加150 mL 70% 乙醇，封口，室溫下放置0、12、24、36、48 h，搖勻，濾過，加70%乙醇補足至150 mL，按“2.1” 項下方法測定芍藥苷含有量。結果，浸泡0、12、24、36、48 h 后該成分含有量分別為0.05、11.32、16.95、17.30、16.89 μg／mL，可知當浸泡時間超過24 h 后其溶出基本上達到平衡狀態(tài)，而且浸泡36、48 h 無明顯差異，故確定處方粉末裝筒后浸泡時間為24 h。

2.4 單因素試驗 本實驗根據(jù)中醫(yī)藥君臣佐使配伍理論和選擇針對病癥具有療效的物質作為評價指標原則，結合各指標理化性質，以芍藥苷總溶出量為評價指標，考察藥材粒度（A）、乙醇體積分數(shù)（B）、滲漉液收集量（C）、滲漉體積流量（D） 對滲漉效果的影響，為Box-Behnken 響應面設計提供依據(jù)。

2.4.1 藥材粒度 參考文獻 ［5］ 報道的方法。根據(jù)2015 年版《中國藥典》 規(guī)定，本實驗選擇細粉（100～80目）、中粉 （80～65 目）、粗 粉 （65～24 目）、最 粗粉（24～10 目）、超粗粉（10～5 目） 進行考察，每種粒度酊劑藥粉各取300 g，600 mL 70%乙醇浸潤后分裝于滲漉筒中，加入70%乙醇浸泡24 h，以2.0 mL／（min·kg）的滲漉體積流量收集12 倍量滲漉液，按“2.1” 項下方法測定芍藥苷總溶出量。結果，當藥材粒度分別為細粉、中粉、粗粉、最粗粉、超粗粉時，該成分總溶出量分別為36.26、37.59、38.29、36.42、34.10 mg，可知它隨著藥材粉末粒度增加呈先升后降的趨勢，主要是因為藥材粉末粒度過小時比表面積比較大，對芍藥苷吸附作用增大，同時顆粒間空隙減小，從而增加滲漉難度；粒度過大時，提高了芍藥苷從藥材中溶出的難度［6］，故確定藥材粒度為粗粉。

2.4.2 乙醇體積分數(shù) 取5 份酊劑粗粉，每份300 g，600 mL 50%、60%、70 %、80%90% 乙醇浸潤后分裝于滲漉筒中，加入上述乙醇浸泡24 h，以2.0 mL／（min·kg）的滲漉體積流量收集12 倍量滲漉液，按“2.1” 項下方法測定芍藥苷總溶出量。結果，當乙醇體積分數(shù)分別為50%、60%、70%、80%、90%時，該成分總溶出量分別為36.14、37.52、38.29、37.28、31.20 mg，故確定乙醇體積分數(shù)為70%。

2.4.3 滲漉液收集量 取5 份酊劑粗粉，每份300 g，600 mL 70%乙醇浸潤后分裝于滲漉筒中，加入70%乙醇浸泡24 h，以2.0 mL／（min·kg）的滲漉體積流量收集6、8、12、15、20 倍量滲漉液，按“2.1” 項下方法測定芍藥苷總溶出量。結果，當滲漉液收集量分別為6、9、12、15、18 倍時，該成分總溶出量分別為24.77、36.24、38.29、38.43、38.18 mg，故確定滲漉液收集量為12 倍。

2.4.4 滲漉體積流量 參考文獻［7］ 報道的方法。取5份酊劑粗粉，每份300 g，600 mL 70%乙醇浸潤后分裝于滲漉筒中，加入70%乙醇浸泡24 h，分別以0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL／（min·kg）的滲漉體積流量收集12 倍量滲漉液，按“2.1” 項下方法測定芍藥苷總溶出量。結果，當滲漉體積流量分別為0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL／（min·kg）時，該成分總溶出量分別為38.62、38.34、38.29、35.15、24.69 mg，故確定滲漉體積流量為0.5 mL／（min·kg）。

2.5 Box-Behnken 響應面法 在單因素試驗基礎上，根據(jù)Box-Behnken 響應面法原理［8-9］，以乙醇體積分數(shù)（B）、滲漉液收集量（C）、滲漉體積流量（D） 為影響因素，以芍藥苷總溶出量為評價指標，優(yōu)化酊劑滲漉工藝。因素水平見表1，結果見表2。

表1 因素水平

表2 試驗設計與結果

通過Design-expert 8.0 軟件進行多元非線性逐步擬合［10］，得二次多元線性擬合方程為Y＝-24.732 13+1.185 22B+3.391 08C-2.359 28D-0.001 33BC+0.010 2BD+0.178CD-0.008 305B2-0.128 39C2-0.305 92D2（R2＝0.907 0），方差分析見表3。由此可知，模型P＜0.01，表明較符合實際滲漉情況；失擬項P＞0.05，表明模型擬合程度較好；因素C、D、B2、C2的P＜0.05，表明它們對滲漉工藝有顯著影響；因素BC、BD、CD的P＞0.05，表明它們之間無顯著交互作用；各因素影響程度依次為C＞D＞B。

表3 方差分析

響應面分析見圖2。由此可知，當固定滲漉體積流量為1.75 mL／（min·kg）時，芍藥苷總溶出量隨著滲漉液收集量增加而升高，隨著乙醇體積分數(shù)增加先升后降；當固定滲漉液收集量為12 倍時，該成分總溶出量隨著乙醇體積分數(shù)增加而升高，到達臨界值后逐漸變小，隨著滲漉體積流量增加而降低；當固定乙醇體積分數(shù)為70%時，該成分總溶出量隨著滲漉液收集量增加而升高，隨著滲漉體積流量增加而降低。最終確定，最優(yōu)工藝為乙醇體積分數(shù)70%，滲漉液收集量12 倍，滲漉體積流量1.75 mL／（min·kg），芍藥苷總溶出量為38.266 mg。

2.6 驗證試驗 為了驗證所建立模型的可靠性，本實驗按“2.5” 項下優(yōu)化工藝進行3 批平行驗證試驗。結果，芍藥苷總 溶出量分別為38.231、38.407、33.015 mg，平 均38.218 mg，與預測值38.266 mg 的偏差為-0.13%，表明工藝準確穩(wěn)定。

3 討論與結論

Box-Behnken 響應面法是一種基于三水平的二階試驗設計方法［11］，與星點設計、正交設計、均勻設計相比具有試驗次數(shù)少、節(jié)約成本、精度高、回歸方程預測性良好等優(yōu)點［12］，但需先根據(jù)因素最佳水平來設定試驗中心點，否則無法得到準確的結果［13］。本實驗首先對化瘀通絡蠲痹酊滲漉工藝有影響的藥粉吸水率、滲漉浸泡時間、藥材粒度、乙醇體積分數(shù)、滲漉液收集量、滲漉體積流量進行單因素試驗，初步確定了參數(shù)范圍，再采用Box-Behnken響應面法考察乙醇體積分數(shù)、滲漉液收集量、滲漉體積流量對芍藥苷總溶出量的影響，得到最優(yōu)工藝為乙醇體積分數(shù)70%，滲漉液 收集量12 倍，滲 漉體積流量為1.75 mL／（min·kg），芍藥苷總溶出量為38.218 mg。經驗證試驗發(fā)現(xiàn)，上述優(yōu)化工藝符合實際生產要求，而且穩(wěn)定可行，預測性良好。

圖2 各因素響應面圖