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        實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法鑒別川貝母摻偽

        2020-06-02 09:31:54薛維娜王愛民何彬王永林李勇軍席曉嵐
        中成藥 2020年5期

        楊 健 李 靖 薛維娜王愛民何 彬王永林李勇軍席曉嵐?劉 亭?

        (1.貴州醫(yī)科大學(xué),貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/省部共建藥用植物功效與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州貴陽550004; 2.貴州醫(yī)科大學(xué),民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心,貴州 貴陽550004;3.貴州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)藥衛(wèi)生管理學(xué)院,貴州 貴陽550025; 4.貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,貴州 貴陽550025)

        川貝母Fritillariae CirrhosaeBulbus 是百合科貝母屬川貝母Fritillaria cirrhosaD.Don、甘肅貝母Fritillaria przewalskiiMaxim.、暗紫貝 母Fritillaria unibracteataHsiao et K.C.Hsia、瓦布貝母Fritillaria unibracteataHsiaoet K.C.Hsia var.wabuensis (S.Y.Tang et S.C.Yue) Z.D.Liu,S.Wang et S.C.Chen、梭砂貝母Fritillaria delavayiFranch.或太白貝母Fritillaria taipaiensisP.Y.Li 的干燥鱗莖[1-2],有化痰止咳、清熱潤肺、散結(jié)消癰之功效[3-5]。由于川貝母的藥用價(jià)值高、療效顯著、市場需求量大,故常有用其他貝母類藥材混充川貝母的現(xiàn)象,如浙貝母、平貝母、伊貝母、湖北貝母等。

        目前川貝母鑒別中最常用且最準(zhǔn)確的是由2015 年版《中國藥典》 收錄的PCR-RFLP 法,該法是一種鑒別單個(gè)川貝母真?zhèn)蔚姆椒ǎ⒉荒芊磻?yīng)樣品的整體情況,不能準(zhǔn)確反應(yīng)樣品的摻偽程度[6-7]。按制藥企業(yè)一次購買川貝母200 kg 以上計(jì)算,按2015 年版《中國藥典》 規(guī)定[8-9],至少需要抽取25~50 g 左右川貝母樣品進(jìn)行檢測,需要進(jìn)行50~100 次PCR-RFLP 反應(yīng),工作量較大,耗時(shí)較長且成本高昂。所以在生產(chǎn)中,常常只取10 g左右川貝母進(jìn)行真?zhèn)舞b別,但是這種取樣方法并不能反應(yīng)樣品的整體情況,不能準(zhǔn)確反應(yīng)樣品的摻偽程度。尤其是在臨床上,川貝母常以粉末形式使用,這更方便了不法分子使用混偽品冒充或摻入川貝母;而混合樣品由于DNA 不純,很難用藥典PCR-RFLP 法來檢測混合粉末樣品中的摻偽程度。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法是一種基于特異性基因序列的快速準(zhǔn)確、靈敏度高的定性定量方法[10]。本研究利用川貝母ITS1 區(qū)序列的特點(diǎn)[11-13],設(shè)計(jì)了2 條特異性鑒別真川貝母的正向引物以及2 條特異性鑒別常見的偽川貝母的正向引物,配合設(shè)計(jì)的反向引物分別組成引物對進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增,以期開發(fā)一種可檢測川貝母樣品摻偽程度的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法。

        1 材料

        DNA 提取試劑盒 (貨號AP-MN-MS-GDNA-50) 購自美國Axygen 公司;GelRed (貨號41003)購自美國Biotium 公司;DNA Marker Ⅰ (貨號MD101) 和50 bp DNA Ladder (貨號MD108) 均購自北京天根生化科技有限公司;SYBR 熒光定量PCR 試劑(貨號RR820Q)、6×Loading Buffer (貨號9156) 均購自日本Takara 公司;KOD-plus 酶(貨號F0 934 K) 均購自日本Toyobo 公司;Sma I酶(貨號ER0661) 購自美國Thermo 公司。G:BOX ChemiXL1.4 型凝膠成像儀(英國Syngene 公司);CFX-96 型熒光定量PCR 儀、PowerpacTMBasic 電泳儀型(美國BIO-RAD 公司);Fresco 17型高速冷凍離心機(jī)(美國Thermo 公司);TMC 振蕩恒溫孵育器(合肥艾本森科學(xué)儀器有限公司)。PCR 引物由英濰捷基(上海) 貿(mào)易有限公司合成,信息見表1。

        對照品川貝母(批號121000-201108)、平貝母(批號120924-201410)、伊貝母(批號120929-201005)、湖北貝母(批號120962-201005)、浙貝母(批號120972-201405) 均購自中國食品藥品檢定研究院。市售川貝母10 批,分別于貴陽市各藥店購買,標(biāo)號依次為CBM-1 至CBM-10。

        表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

        2 方法

        2.1 基因組DNA 提取 稱取樣品粉末0.5 g 于5 mL 離心管中,按基因組提取試劑盒說明提取DNA,最后加入20 μL 雙蒸水洗脫,得到樣品基因組DNA,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        2.2 PCR-RFLP 反應(yīng) 引物使用PCR-RFLP 引物,按2015 年版《中國藥典》 方法進(jìn)行操作。30 μL PCR 體系為 10 × PCR 緩沖液 3 μL,MgCl2(25 mmoL/L ) 2.4 μL,dNTP (10 mmoL/L )0.6 μL,正向引物(30 μmoL/L) 0.5 μL,反向引物(30 μmoL/L) 0.5 μL,基因組DNA 200 ng,KOD-plus 酶(5 U/μL) 0.2 μL,無菌雙蒸水補(bǔ)足至30 μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性4 min;擴(kuò)增30 個(gè)循環(huán)(95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s);72 ℃延伸5 min。

        取PCR 反應(yīng)液置于1.5 mL 離心管中,利用SmaⅠ酶對其進(jìn)行酶切。反應(yīng)體系為10×酶切緩沖液2 μL,PCR 反應(yīng)液6 μL,SmaⅠ酶(10 U/μL)0.5 μL,無菌水補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)在30 ℃水浴中進(jìn)行2 h。樣品利用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,電壓5 V/cm;電泳時(shí)間30 min,使用凝膠成像儀拍照并保存圖像。

        2.3 熒光定量PCR 反應(yīng) 2×SYBR PCR 緩沖液2 μL,正向引物(10 μmoL/L) 0.3 μL,反向引物(10 μmoL/L) 0.3 μL,基因組DNA 200 ng,無菌雙蒸水補(bǔ)足至20 μL。94 ℃預(yù)變性4 min;擴(kuò)增40個(gè)循環(huán),每個(gè)循環(huán)包括以下步驟,94 ℃ 30 s,68 ℃30 s,讀板獲取熒光信息。

        2.4 考察引物對1~4 鑒別川貝母的準(zhǔn)確性

        2.4.1 鑒別川貝母、平貝母、湖北貝母、浙貝母、伊貝母 取川貝母、平貝母、湖北貝母、浙貝母和伊貝母對照品的基因組DNA。分別用引物對1~4,按“2.3” 項(xiàng)下方法進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,并用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物。電泳條件為恒壓,電壓為5 V/cm;電泳時(shí)間30 min。結(jié)果與PCR-RELP 法進(jìn)行比較。

        2.4.2 鑒別市售川貝母 取市售川貝母樣品(CBM-1 至CBM-10) 各50 g,依次用滅菌水、75%乙醇和雙蒸水清洗,置于超凈工作臺晾干,轉(zhuǎn)至另一個(gè)研缽中,研磨成細(xì)粉。按“2.1” 項(xiàng)下方法提取基因組DNA。分別用引物對1~4,按“2.3” 項(xiàng)下方法進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,并用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物。電泳條件為恒壓,電壓為5 V/cm;電泳時(shí)間為30 min。結(jié)果與PCR-RELP法進(jìn)行比較。

        2.5 川貝母樣品摻偽程度檢測

        2.5.1 對照品混合樣品制備 取川貝母、浙貝母、平貝母、伊貝母和湖北貝母對照品(粉末),分別按表2 混合川貝母真品和偽品。

        2.5.2 市售樣品混合樣品制備 分別取市售川貝母樣品中鑒別為川貝母真品和川貝母偽品的樣品,在研缽中研磨成細(xì)粉,分別按表2 混合川貝母真品和偽品。

        2.5.3 PCR 檢測 利用真川貝母鑒別引物(引物1 或引物2),進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增,得到Ct值(Ct真)[14];利用偽川貝母鑒別引物(引物3或引物4) 配合反向引物,進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增,得到Ct值(Ct偽),則川貝母混合樣品的摻偽比例=1/ [(1+2-(Ct真-Ct偽)] × 100%。

        進(jìn)行熒光定量PCR 反應(yīng)時(shí),引物對1 和引物對3 配合使用,引物對2 和引物對4 配合使用。

        表2 川貝母和偽品混合比例Tab.2 Mixed proportion of F.Cirrhosae and counterfeit

        3 結(jié)果

        3.1 PCR-RFLP 反應(yīng)鑒別 利用PCR-RFLP 引物,按《中國藥典》 方法對川貝母、平貝母、湖北貝母、浙貝母和伊貝母對照品進(jìn)行PCR-RFLP 反應(yīng),結(jié)果見圖1。經(jīng)SmaⅠ酶切后,川貝母對照品在100~250 bp 之間出現(xiàn)了2 條酶切條帶,與藥典規(guī)定相符;浙貝母、平貝母、伊貝母和湖北貝母對照品在100~250 bp 之間沒有酶切條帶,均符合藥典。

        圖1 各對照品PCR-RFLP 反應(yīng)電泳圖譜Fig.1 PCR-RFLP electrophoresis of various reference samples

        3.2 PCR 鑒別結(jié)果 利用特異性引物對1~4,對川貝母對照品的基因組DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,結(jié)果見圖2。在引物對1~2 的作用下,川貝母對照品擴(kuò)增出了200 bp 左右的條帶,而引物對3~4 不能引發(fā)PCR 擴(kuò)增,符合理論預(yù)期。這一檢測結(jié)果與藥典PCR-RFLP 結(jié)果相符,表明當(dāng)PCR 反應(yīng)模板為川貝母真品時(shí),本研究所述的引物對1~2 可以引發(fā)PCR 擴(kuò)增,得到200 bp 左右的產(chǎn)物;而引物對3、4 不能引發(fā)PCR 擴(kuò)增。

        圖2 引物對1~4 對川貝母對照品進(jìn)行PCR 擴(kuò)增的電泳圖譜Fig.2 PCR electrophoresis of primers pairs 1-4 of F.Cirrhosae reference samples

        圖3 引物對1~4 對各樣品進(jìn)行PCR 擴(kuò)增的電泳圖譜Fig.3 Electrophoresis of PCR amplification of various samples with primers 1-4

        3.3 引物對1~4 鑒別 利用特異性引物對1~4,對浙貝母、平貝母、伊貝母、湖北貝母的基因組DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,結(jié)果見圖3。當(dāng)PCR 反應(yīng)模板為川貝母偽品(浙貝母、平貝母、伊貝母和湖北貝母) 時(shí),本研究所述的引物對1~2 不能引發(fā)PCR 擴(kuò)增;本研究所述的引物對3~4 能引發(fā)PCR擴(kuò)增,得到200 bp 左右的產(chǎn)物。

        3.4 PCR-RFLP 反應(yīng)鑒別市售川貝母 按2015 年版《中國藥典》 規(guī)定,川貝母真品經(jīng)SmaⅠ酶切后,產(chǎn)生2 條新的條帶且大小在100~250 bp 之間。由酶切后的電泳圖見圖4,CBM-1、CBM-2、CBM-5、CBM-6、CBM-8、CBM-10 6 批藥材和川貝母對照品一樣,在100~250 bp 之間有2 條帶,表明均為真品;而CBM-3、CBM-4、CBM-7、CBM-9 4 批藥材和平貝母對照品一樣沒有條帶,表明均為偽品。

        3.5 引物對1~4 鑒別市售川貝母 根據(jù)本研究所得結(jié)論,川貝母真品經(jīng)引物對1~2 PCR 擴(kuò)增后,應(yīng)該出現(xiàn)一條200 bp 左右的條帶;而川貝母偽品經(jīng)引物對3~4 PCR 擴(kuò)增后,應(yīng)該出現(xiàn)一條200 bp左右的條帶。結(jié)果見圖5,市售川貝母樣品經(jīng)引物對1~4 擴(kuò)增后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與“3.4” 項(xiàng)一致,表明本研究所設(shè)計(jì)的特異性引物可用于鑒別川貝母真?zhèn)巍?/p>

        圖4 PCR-RFLP 法鑒別市售川貝母的電泳圖譜Fig.4 Electrophoresis of F.Cirrhosae samples identified by PCR-RFLP

        圖5 市售川貝母樣品熒光定量PCR 產(chǎn)物電泳圖譜Fig.5 Electrophoresis of PCR samples of F.Cirrhosae

        3.6 熒光定量PCR 法鑒別川貝母及常見偽品的混合樣品摻偽 川貝母對照品及常見川貝母偽品對照品的混合樣品經(jīng)真川貝母鑒別引物對1~2 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增得到Ct值記為Ct真;經(jīng)偽川貝母鑒別引物對3~4 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增得到Ct值記為Ct偽,經(jīng)計(jì)算得到相應(yīng)的混合樣品的摻偽比例,結(jié)果見表3~4。結(jié)果顯示,計(jì)算所得川貝母摻偽比例與實(shí)際的偽品含有量接近。

        3.7 熒光定量PCR 法檢測市售川貝母混合樣品摻偽 市售川貝母混合樣品經(jīng)引物對1~4 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增后,分別得到Ct真和Ct偽,經(jīng)計(jì)算得到相應(yīng)的混合樣品的摻偽比例,結(jié)果見表5。計(jì)算所得川貝母摻偽比例與實(shí)際的偽品含有量接近。

        表3 引物對1~3 混合川貝母樣品的摻偽程度檢測結(jié)果Tab.3 Degree results of detecting the adulteration of mixed samples by primers 1-3

        表4 引物對2~4 檢測混合川貝母樣品的摻偽程度結(jié)果Tab.4 Degree results of detecting the adulteration of mixed samples by primers 2-4

        表5 引物對1、3,2、4 檢測市售川貝母混合樣品摻偽程度結(jié)果Tab.5 Degree results of detecting the adulteration of mixed samples by primers 1,3 and primers 2,4

        4 討論

        本研究設(shè)計(jì)的真川貝母鑒別引物以川貝母ITS1 區(qū)的第75 位堿基“C” 為3′未端,偽川貝母鑒別引物以偽川貝母ITS1 區(qū)的第75 位堿基“T”為3′未端[11]。2 種引物的3′端的第3 個(gè)堿基處,都引入了堿基錯(cuò)配,增加了鑒別的特異性和準(zhǔn)確性。本研究所述的引物對1~4 可以用于鑒別川貝母真品和浙貝母、平貝母、伊貝母、湖北貝母等常見川貝母偽品,準(zhǔn)確率與2015 年版《中國藥典》收錄的PCR-RELP 法一致,不會出現(xiàn)假陽性擴(kuò)增;且可用于市售川貝母的真?zhèn)舞b別,同樣,無假陽性擴(kuò)增出現(xiàn)。

        本研究首次利用熒光定量PCR 法實(shí)現(xiàn)對川貝母摻偽品的相對定量檢測,利用設(shè)計(jì)的川貝母真品鑒別引物對1~2,進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增,得到Ct 值(Ct真);利用川貝母偽品鑒別引物對3~4,進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò) 增,得到Ct 值(Ct偽)。只需同時(shí)進(jìn)行2 次實(shí)時(shí)熒光定量擴(kuò)增,再通過簡單計(jì)算即可檢測川貝母樣品中常見偽品的摻偽程度,無需進(jìn)行酶切,且該法允許大量取樣,這極大減少了工作量,縮短了檢測時(shí)間,并且準(zhǔn)確度高,從而能更好的推廣川貝母的分子鑒定。與傳統(tǒng)的PCR-PFLP 法相比,消除了有毒有害試劑對試驗(yàn)人員的影響,并且能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測試驗(yàn)結(jié)果,操作更加便捷,大大縮短檢測周期[15],以期為川貝母的檢測提供參考。

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