段偉萍李緣嬡鄭云楓 李存玉 陸兔林陳麗紅彭國(guó)平

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京210023； 2.江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過(guò)程協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京210023； 3.南京中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)家教育部中藥炮制規(guī)范化及標(biāo)準(zhǔn)化工程研究中心，江蘇 南京210023）

甘草為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.、脹果甘草Glycyrrhiza inflataBat.或光果甘草Glycyrrhiza glabraL.的干燥根及根莖，是最常用的中藥之一［1-2］。歷代以來(lái)，甘草的臨床應(yīng)用以生、炙甘草為主，其中炙甘草是由生甘草拌入煉蜜后加熱炮制而來(lái)［3］，具有補(bǔ)脾和胃、益氣復(fù)脈之功效［1］?？紤]到中藥炮制功效的改變與化學(xué)成分變化存在著密切的關(guān)系，有研究采用HPLC 指紋圖譜技術(shù)對(duì)甘草蜜炙前后色譜圖進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)生、炙甘草中一些色譜峰面積存在差異［4-5］；也有文獻(xiàn)對(duì)甘草蜜炙前后甘草苷、甘草酸等主要指標(biāo)性成分進(jìn)行定量分析研究，結(jié)果顯示在炮制過(guò)程中成分出現(xiàn)了增減變化［6-7］。

本研究在前期研究的基礎(chǔ)上［8-10］，采用LCMS／MS 定性鑒別結(jié)合Marker View 軟件分析，系統(tǒng)解析了生、炙甘草水溶性差異成分，進(jìn)一步以HPLC 梯度波長(zhǎng)法檢測(cè)了炮制前后黃酮及三萜皂苷水溶性成分的含有量變化，以期為炙甘草的炮制及質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料

AB SCIEX Triple TOFTM5600 質(zhì)譜儀，電噴霧離子源（ESI），Analyst TF 1.6 和Peak View 1.2 軟件（美國(guó)AB 公司）；Agilent 1100 高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司）；JCS-1000 電子天平（凱豐集團(tuán)有限公司）；AL204 電子分析天平（萬(wàn)分之一，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）；BT125D 分析天平（十萬(wàn)分之一，德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）。

對(duì)照品芹糖甘草苷 （JBZ180106-139，純度98.1%）、芹糖異甘草苷 （JBZ180205-813，純度98.5%）、異甘草 苷 （JBZ180314-015，純 度98.3%） 均購(gòu)自南京金益柏生物科技有限公司；對(duì)照品甘草苷（111610-201607，純度93.1%）、甘草酸銨（110731-201619，純度97.0%） 均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；對(duì)照品22β-乙酰甘草酸、甘草皂苷G2、烏拉爾皂苷B，均由實(shí)驗(yàn)室自制，經(jīng)HPLC 分析，純度≥99.0%。乙腈、甲酸均為色譜純（德國(guó)Merck 公司），水為Milli-Q 超純水，其他試劑均為分析純。

6 批生甘草飲片購(gòu)自內(nèi)蒙古億利資源集團(tuán)有限公司甘草分公司（批號(hào)20181101～20181106）。經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)鑒定教研室嚴(yán)輝副教授鑒定為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的干燥根和根莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 炙甘草制備 蜜炙甘草，取煉蜜（100 g 生甘草用煉蜜25 g） 加少量水稀釋，加入生甘草飲片中拌勻，稍燜，用文火炒至深黃色、透香氣、不粘手時(shí)取出放涼。

2.2 供試品溶液制備 取生甘草或炙甘草樣品粉末（過(guò)3 號(hào)篩） 約0.5 g，精密稱定，加入水25 mL，置100 mL 圓底燒瓶，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，放至室溫，補(bǔ)足減失質(zhì)量，濾過(guò)，精密移取續(xù)濾液5 mL，置10 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，離心（8 000 r／min，10 min） 取上清液，即得。

2.3 對(duì)照品溶液制備 取8 種對(duì)照品適量，精密稱定，加50%甲醇溶解，搖勻，制成芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖異甘草苷、異甘草苷、22β-乙酰甘草酸、甘草皂苷G2、甘草酸、烏拉爾皂苷B 質(zhì)量濃度分別272.20、231.71、67.50、86.00、246.68、242.24、715.56、92.00 mg／mL 的混合 對(duì)照品溶液。

2.4 色譜條件 Hedera C18色譜柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈 （A） -0.2% 甲酸（B），梯度洗脫（0～15 min，19%～25% A；15～25 min，25%～30% A；25～41 min，30%～45% A，41～ 60 min，45%～ 70% A）；體積流 量1.0 mL／min；柱溫25 ℃；0～15 min 在276 nm 下檢測(cè)芹糖甘草苷和甘草苷，15～25 min 在360 nm下檢測(cè)芹糖異甘草苷和異甘草苷，25～60 min 在254 nm 下檢測(cè)22β-乙酰甘草酸、甘草皂苷G2、甘草酸和烏拉爾皂苷B；進(jìn)樣量10 μL。

2.5 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI）；正、負(fù)離子檢測(cè)模式；一級(jí)質(zhì)譜條件為掃描范圍m／z50～1 500；毛細(xì)管溫度550 ℃；離子噴霧空載電壓5 500 V／-4 500 V，解簇電壓100 V／-100 V，碰撞能量10 V／-10 V，噴霧電壓5 500 V，解簇電壓100 V；二級(jí)質(zhì)譜條件為掃描范圍m／z50～1 500，解簇電壓100 V／-100 V，碰撞能量35 V／-35 V，碰撞能量幅度-20 V，霧化器60 psi （1 psi ＝6.985 kPa），輔助加熱器60 psi，氣簾氣40 psi。

2.6 定性分析

2.6.1 差異性化合物分析 按“2.2” “2.3” 項(xiàng)下方法制備供試品和對(duì)照品溶液。采用正、負(fù)離子模式分別進(jìn)行LC-MS／MS 檢測(cè)，結(jié)果顯示，在負(fù)離子模式條件下生、炙甘草中黃酮、三萜皂苷類成分的質(zhì)譜響應(yīng)值較高，見圖1。

圖1 生、炙甘草水溶性成分LC-MS／MS （-） TIC Fig.1 LC-MS／MS （-） TIC of water-soluble components from raw and honey-roasted licorice

依據(jù)LC-MS／MS 所測(cè)樣本保留時(shí)間、各色譜峰離子響應(yīng)強(qiáng)度和二級(jí)質(zhì)譜信息，在 Marker View1.2.1 軟件中設(shè)置質(zhì)譜處理參數(shù)為最小保留時(shí)間3.0 min，最大保留時(shí)間60.0 min，最小質(zhì)荷比寬度10×10-6，最小保留時(shí)間寬度6 scans，噪波閾值100，保留時(shí)間容差16 min，質(zhì)荷比容差1×10-6［11］，最大峰數(shù)目500，選擇色譜峰響應(yīng)值≥e3，去除同位素峰；進(jìn)一步將生、炙甘草兩組LCMS／MS 總離子流圖導(dǎo)入Marker View 軟件中，對(duì)兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，獲得差異性成分的Log （Fold change） versus p-value 圖，見圖2，圖中每個(gè)散點(diǎn)代表一種差異性成分，其位置離X 軸越遠(yuǎn)，代表該成分在生、炙甘草樣本中的差異性越大；以∣Log （Fold change） ∣≥0.10 為界值，篩選出了33種顯著的差異性成分，見圖1。

圖2 生、炙甘草差異性成分Log （Fold change）versus p-value 圖Fig.2 Log （Fold change） versus p-value of different components of raw and honey-roasted licorice

2.6.2 差異性成分定性鑒別 依據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)Chemspider、Scifinder 檢索以及甘草化學(xué)成分研究報(bào)道，建立甘草化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)而對(duì)各主要差異性成分的質(zhì)譜信息進(jìn)行識(shí)別與矯正，推測(cè)化合物結(jié)構(gòu)。其中，峰2，4，7，17，19，22 和24 由對(duì)照品對(duì)照進(jìn)行了確認(rèn)，分別為芹糖甘草苷、甘草苷、異甘草苷、22β-乙酰甘草酸、甘草皂苷G2、甘草酸和烏拉爾皂苷B。其他成分依據(jù)已建立的目標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)分子式匹配以及化合物質(zhì)譜裂解碎片信息進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定［12-16］。其中，甘草黃酮類成分在負(fù)離子模式下碎片信息豐富，常見特征分子量丟失 為15 Da （CH3）、18 Da （H2O）、32 Da（OCH3）、56 Da （（CH3）2CH ＝CHCH3）、132 Da（芹糖）、162 Da （葡萄糖） 等；而三萜皂苷成分在負(fù)離子模式下碎片信息較少，而在正離子質(zhì)譜中可見糖取代基分子量丟失132 Da （木糖）、146 Da（鼠李糖）、162 Da （葡萄糖）、176 Da （葡糖糖醛酸），以及苷元上取代基的特征分子量丟失30 Da（C24-OH）、36 Da （2×18，C22-OH）、46 Da （C20-COOH）、60 Da （C22-OAc） 等。

以峰16 為例，在正離子模式下該化合物準(zhǔn)分子離子峰為m／z825.425 2 ［M+H］+，確定其分子式為C42H64O16，提示該化合物可能為Uralsaponin C；此外，在峰16 的二級(jí)質(zhì)譜中可見2 個(gè)連續(xù)脫去葡萄糖醛酸基的碎片離子m／z649.393 6 ［M+HC6H8O6］+和473.361 7 ［M+H-2C6H8O6］+，確定結(jié)構(gòu)中有2 個(gè)葡萄糖醛酸取代基，同時(shí)從苷元離子連續(xù)脫去2 分子H2O 可見碎片離子m／z437.361 7［M+H-2C6H8O6-2H2O］+，表明苷元結(jié)構(gòu)22 位上有羥基取代，以上結(jié)構(gòu)鑒定信息與Uralsaponin C 相一致，最終峰16 鑒定為Uralsaponin C。依據(jù)以上差異性成分定性鑒定方法，共推測(cè)鑒定了30 種成分，包括12 種黃酮及18 種三萜皂苷，相關(guān)質(zhì)譜信息及化合物結(jié)構(gòu)分別見表1、圖3。

表1 甘草蜜炙前后差異性成分定性鑒別Tab.1 Qualitative identification of the differential ingredients between raw and honey-roasted licorice

2.7 含有量變化分析 為了更準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)炮制前后主要特征差異性成分的含有量變化，依據(jù)LCMS／MS 數(shù)據(jù)及Marker View 軟件分析，選擇了4 種黃酮類成分為芹糖甘草苷 （Q-LQ）、甘草苷（LQ）、芹糖異甘草苷（Q-ILQ）、異甘草苷（ILQ）及4 個(gè)三萜皂苷類成分為22β-乙酰甘草酸（22β-AGA）、甘草皂苷G2 （LS-G2）、甘草酸 （GA）、烏拉爾皂苷B （US-B） 為指標(biāo)，采用HPLC 梯度波長(zhǎng)進(jìn)行了含有量測(cè)定與對(duì)比分析，見圖4。

圖3 差異性成分結(jié)構(gòu)Fig.3 Chemical structure of differential components

2.7.1 方法學(xué)考察

2.7.1.1 精密度試驗(yàn) 按“2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.4” 項(xiàng)色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得4 種黃酮和4 種三萜皂苷的色譜峰保留時(shí)間和峰面積RSD 均小于2.01%，表明儀器精密度良好。

2.7.1.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.4” 項(xiàng)色譜條件下，分別于0、2、4、6、12、24 h 進(jìn)樣，測(cè)得4 種黃酮和4種三萜皂苷的色譜峰保留時(shí)間和峰面積RSD 均小于2.44%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7.1.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱定同一批次樣品6份，按“2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.4” 項(xiàng)色譜條件下分別進(jìn)樣，測(cè)得4 種黃酮和4種三萜皂苷的色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD 均小于1.80%，表明該方法重復(fù)性良好。

圖4 各成分HPLC 色譜圖Fig.4 HPLC chromatograms of various constituents

2.7.1.4 線性關(guān)系考察 取8 種對(duì)照品混合溶液適量，逐級(jí)稀釋成系列濃度的混合對(duì)照品溶液，分別吸取10 μL，在“2.4” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），各對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），進(jìn)行回歸，結(jié)果見表2。表明各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.7.2 差異性特征成分定量分析 分別取6 批生甘草及6 批炙甘草，按“2.2” “2.4” 項(xiàng)下方法分別制備供試品溶液并進(jìn)行測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算8種成分的含有量，采用GraphPad Prism 7.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析。結(jié)果顯示，生甘草在蜜炙后芹糖甘草苷、甘草苷、22β-乙酰甘草酸、甘草皂苷G2、甘草酸和烏拉爾皂苷B 成分均下降 （P＜0.01）；異甘草苷含有量升高（P＜0.05），芹糖異甘草苷變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖5。

圖5 生、炙甘草中差異性特征成分含有量比較Fig.5 Comparison of different characteristic components in raw and honey-roasted licorice

考慮到生甘草炮制過(guò)程中加入的煉蜜會(huì)對(duì)炙甘草中成分的實(shí)際含有量產(chǎn)生影響，參考文獻(xiàn)［17］以每100 g 炙甘草中含干燥蜂蜜量12 g 計(jì)，扣除蜂蜜質(zhì)量計(jì)算炙甘草各成分實(shí)際含有量。結(jié)果顯示，黃酮類成分芹糖異甘草苷和異甘草苷平均含有量分別上升5.11%、25.94%，甘草苷和芹糖甘草苷含有量分別下降21.77%、18.43%，而甘草酸等4 種三萜皂苷成分平均含有量均出現(xiàn)下降，幅度在10.07%～16.69%，結(jié)果見表3。

表3 生、炙甘草中各成分含有量變化（，n＝6，mg·g-1）Tab.3 Content change of various constituents in raw and honey-roasted licorice （，n＝6，mg·g-1）

表3 生、炙甘草中各成分含有量變化（，n＝6，mg·g-1）Tab.3 Content change of various constituents in raw and honey-roasted licorice （，n＝6，mg·g-1）

3 討論

傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為，甘草經(jīng)蜜炙后功效“由清轉(zhuǎn)補(bǔ)”，補(bǔ)脾和胃、益氣復(fù)脈功效增強(qiáng)，有研究表明，甘草蜜炙后補(bǔ)脾益氣藥效作用增強(qiáng)，且明顯優(yōu)于生甘草及清炒品［18］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)開展蜜炙對(duì)甘草化學(xué)成分的影響研究，發(fā)現(xiàn)生、炙甘草水溶性化學(xué)成分存在一定的差異，具體表現(xiàn)為，甘草蜜炙后芹糖異甘草苷和異甘草苷含有量上升，芹糖甘草苷和甘草苷含有量下降，基于黃酮成分結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化規(guī)律，應(yīng)為二氫黃酮成分芹糖甘草苷和甘草苷在炮制加熱過(guò)程中B 環(huán)開環(huán)轉(zhuǎn)化為芹糖異甘草苷和異甘草苷所致，有文獻(xiàn)表明異甘草苷等甘草黃酮類成分具有抗心律失常［19-21］、保護(hù)胃黏膜［22］等作用。炙甘草“益氣復(fù)脈” 功效，主要表現(xiàn)為增強(qiáng)抗心律失常作用，因此異黃酮類成分的轉(zhuǎn)化及含有量提升，可能與炙甘草益氣復(fù)脈功效的增強(qiáng)有關(guān)。

考慮甘草生、炙品在傳統(tǒng)臨床使用、配方顆粒和經(jīng)典名方開發(fā)均以水為溶劑進(jìn)行提取或制備，且生、炙甘草中主要活性成分黃酮和皂苷均具有一定的水溶性，因而本實(shí)驗(yàn)選擇水回流提取的方式。此外，在含有量測(cè)定過(guò)程中采用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示芹糖甘草苷和甘草苷等二氫黃酮類成分在276 nm 波長(zhǎng)條件下有較大吸收，芹糖異甘草苷和異甘草苷成分在360 nm 波長(zhǎng)條件下吸收較強(qiáng)，而三萜皂苷類成分如甘草酸等在254 nm 波長(zhǎng)吸收強(qiáng)度最強(qiáng)，因此本實(shí)驗(yàn)選擇了梯度波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)。

本實(shí)驗(yàn)研究方法能夠快速、系統(tǒng)地分析甘草蜜炙前后黃酮及三萜皂苷的成分變化，而差異性組分的解析可為炙甘草炮制及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供一定的依據(jù)。但甘草中除了黃酮及三萜皂苷類成分外，還含有多糖及寡糖類組分［23］，輔料蜂蜜也含有果糖、葡萄糖等成分［24］，在甘草蜜炙過(guò)程中糖類組分如何發(fā)生變化，尚待后續(xù)作進(jìn)一步探索。