李 寧 高小惠?王子幼龔云麒?劉軍鋒楊兆祥崔秀明王崢濤

（1.昆藥集團(tuán)股份有限公司，云南 昆明650100； 2.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所教育部中藥標(biāo)準(zhǔn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海201203； 3.云南省三七資源可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明650500）

三七為五加科人參屬植物三七Panax notoginseng（Burk.） F.H.Chen 的干燥根和根莖［1］。三七是我國傳統(tǒng)名貴大宗藥材，具有活血散瘀、消腫定痛的功效，目前常用于預(yù)防和治療心腦血管系統(tǒng)疾病。三七主產(chǎn)于云南，種植基地規(guī)模大，有效成分較清楚，臨床療效確切，市場前景廣闊。云南省已出臺三七產(chǎn)業(yè)“十三五” 發(fā)展規(guī)劃，擬將三七培育打造成千億級產(chǎn)業(yè)［2］。

中成藥大品種是三七產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要推手。血塞通系列產(chǎn)品是以三七根莖總皂苷制成的中成藥，是目前重要的心腦血管用藥［3-4］。三七于1985 年最早獲得血塞通注射液生產(chǎn)批文，并于1996 年獲得注射用血塞通凍干生產(chǎn)批文。除注射劑外，目前該產(chǎn)品已發(fā)展成包括軟膠囊、硬膠囊、滴丸、片劑、泡騰片、咀嚼片、分散片、顆粒劑等多種劑型的產(chǎn)品集群。

質(zhì)量是藥品療效的根本保證，是優(yōu)質(zhì)中成藥評價(jià)的核心?；趶脑稀⑸a(chǎn)、質(zhì)控、再評價(jià)到其他競爭力的全鏈條質(zhì)量評價(jià)體系應(yīng)成為優(yōu)質(zhì)中成藥評價(jià)的核心標(biāo)準(zhǔn)。優(yōu)質(zhì)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系應(yīng)包括原料、中間體、輔料、包材等一系列標(biāo)準(zhǔn)［5］。就血塞通產(chǎn)業(yè)而言，缺乏符合血塞通特點(diǎn)的三七根莖藥材標(biāo)準(zhǔn)是亟待解決的重要問題。根與根莖屬于三七植物的不同部位。雖然三七已被《中國藥典》 我國《香港中藥材標(biāo)準(zhǔn)》 和《臺灣中藥典》 《美國草藥典》 《歐洲藥典》 《英國藥典》 及ISO 標(biāo)準(zhǔn)等多個(gè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系收載［4，6］，但《香港中藥材標(biāo)準(zhǔn)》《臺灣中藥典》 《歐洲藥典》 《英國藥典》 僅收載根，不包含根莖。《中國藥典》 《美國草藥典》 中根與根莖混列。目前已有較多的研究表明三七根與根莖的質(zhì)量存在較明顯的差異性，化學(xué)成分及含有量均有不同［7-9］。ISO 標(biāo)準(zhǔn)中雖將根與根莖分列，但無指紋圖譜測定項(xiàng)，含有量測定僅包含三七皂苷R1、人參皂苷Rb1和人參皂苷Rg13 種成分。注射用血塞通凍干現(xiàn)行的國家標(biāo)準(zhǔn)對成品的質(zhì)量進(jìn)行了較嚴(yán)格的限定，規(guī)定指紋圖譜相似度不得低于0.95，且分別對三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1和人參皂苷Rd 5 種成分含有量的上、下限進(jìn)行了規(guī)定［10］。

本研究建立三七HPLC 指紋圖譜，并同時(shí)測定三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd 的含有量，以期為制訂符合血塞通特點(diǎn)的三七根莖藥材標(biāo)準(zhǔn)提供基礎(chǔ)性研究資料。

1 材料

ACQUITY Arc 高效液相色譜儀（包括紫外檢測器、柱溫箱、自動進(jìn)樣器、在線脫氣機(jī)、四元梯度泵） （美國Waters 公司）；XP205、XPE26 分析電子天平（瑞士Mettler 公司）；5510E-DTH 超聲提取儀（美國Branson 公司）；VD53 真空干燥箱（德國Binder 公司）；Milli-Q 超純水機(jī)（美國Millipore 公司）。

15 批三七根莖藥材，批號見表1，由昆藥集團(tuán)股份有限公司提供，均購自云南文山，為注射用血塞通凍干實(shí)際生產(chǎn)用藥材，所有藥材經(jīng)昆藥集團(tuán)股份有限公司李寧博士鑒定為正品，憑證標(biāo)本存放于昆藥集團(tuán)股份有限公司研究院天然產(chǎn)物部。三七總皂苷對照品（批號101176-201202） 購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈、甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液制備 取三七根莖藥材粉末（過4 號篩） 0.3 g，精密稱定至離心管中，加入70%甲醇水溶液10 mL，超聲10 min，離心，轉(zhuǎn)移上清液至25 mL 量瓶中，重復(fù)提取2 次，每次加入70%甲醇水溶液5 mL，合并3 次提取液，定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2 對照品溶液制備 精密稱取三七總皂苷對照提取物適量，加入70%甲醇水溶液制成每1 mL 含2.5 mg 的溶液，即得。

2.3 色譜條件 Waters XBridge C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈（A） -水（B），梯度洗脫（0～20 min，19% A；20～45 min，19%～46% A；45～50 min，46%～100% A；50～60 min，100% A）；體積流量1.5 mL／min；檢測波長203 nm；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量20 μL。

2.4 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取同一批號樣品 （批號KY170418），按 “2.1” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3” 項(xiàng)條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次，測得各色譜圖的相似度均大于0.99，三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rd 色譜峰保留時(shí)間、峰面積RSD 分別為0.04%～0.23%、0.26%～0.49%。表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號樣品 （批號KY170418），按 “2.1” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣，測得各色譜圖的相似度均大于0.99，三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rd 色譜峰保留時(shí)間與峰面積RSD 分別為0.03%～0.61%、0.64%～1.78%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批號樣品 （批號KY170418），按 “2.1” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3” 項(xiàng)條件下，分別于制備后0、2、4、8、12、18、24、36、48、60 h 進(jìn)樣，測得各色譜圖的相似度均大于0.99，三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rd色譜峰保留時(shí)間與峰面積RSD 分別為0.11%～1.95%、1.65%～2.11%。表明供試品溶液在60 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 指紋圖譜建立 取不同批次三七根莖藥材共15 批，按“2.1” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣，將所得的色譜圖輸入相似度評價(jià)軟件進(jìn)行相似度比較，剪切5 min 之前和45 min 之后的色譜峰，采用中位數(shù)法生成參照指紋圖譜。各批次藥材指紋圖譜的疊加圖及共有模式指紋圖譜分別見圖1～2。以共有模式為參照，計(jì)算各批次樣品的相似度，結(jié)果見表1，所有批次樣品的相似度均在0.99 以上。指紋圖譜中可見5 個(gè)主要共有峰，占總峰面積90% 以上。與對照提取物色譜圖對照保留時(shí)間，共有峰1～5 分別指認(rèn)鑒定為三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rd。

圖1 15 批樣品HPLC 指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints of fifteen batches of samples

圖2 15 批樣品共有模式圖Fig.2 Common patterns of fifteen batches of samples

表1 15 批樣品相似度Tab.1 Similarities of fifteen batches of samples

2.6 含有量測定方法學(xué)考察 本研究建立的指紋圖譜分析方法可同時(shí)對三七根莖藥材中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd 5 種主要成分進(jìn)行含有量測定。方法的精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)參見“2.4” 項(xiàng)下部分。

2.6.1 專屬性試驗(yàn) 取樣品（批號KY170418），按“2.1” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，取三七總皂苷對照品，按“2.2” 項(xiàng)下方法制備對照品溶液，取70%甲醇水溶液為空白溶液，分別在“2.3” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣?？瞻兹芤荷V圖中無干擾峰影響定量。對照品溶液與供試品溶液色譜圖中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd 色譜峰與相鄰峰分離良好（分離度大于1.5）。結(jié)果表明該方法專屬性良好。見圖3。

2.6.2 線性關(guān)系考察 精密稱取三七總皂苷對照品，以70%甲醇水溶液溶解并逐級稀釋成一系列不同質(zhì)量濃度。在“2.3” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸，結(jié)果見表2，表明各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖3 各成分HPLC 色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of various constituents

2.6.3 加樣回收率試驗(yàn) 分別取已知含有量樣品（批號KY170418） 9 份，每份約0.15 g，精密稱定。分3 組各分別加入50%、100%、150%的對照品。按“2.1” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣，計(jì)算加樣回收率。三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd 的平均加樣回收率分別為101.78%、97.22%、102.14%、98.96%、101.73%，RSD 值分別 為 1.58%、1.31%、2.17%、1.55%、1.80%。

2.7 樣品含有量測定 取15 批樣品，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，取三七總皂苷對照品，按“2.2” 項(xiàng)下方法制備對照品溶液，分別在“2.3” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣，計(jì)算各成分的含有量，結(jié)果見表3。

3 討論

三七的質(zhì)量評價(jià)研究為中藥、天然藥物的研究熱點(diǎn)，已有相當(dāng)多的文獻(xiàn)報(bào)道，三七也被國內(nèi)外眾多質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系收載。目前三七廣泛用于中成藥制劑［11-12］，我國含三七中成藥品種共計(jì)455 個(gè)，總計(jì)超過2 000 個(gè)［2］。三七作為大宗常用藥材，現(xiàn)有的藥材標(biāo)準(zhǔn)在制訂過程中注重標(biāo)準(zhǔn)的普適性。對于具體的中成藥品種而言，并非最優(yōu)的原料藥材標(biāo)準(zhǔn)［13］。為保障中成藥質(zhì)量的優(yōu)質(zhì)性，應(yīng)結(jié)合產(chǎn)品特點(diǎn)量身制訂適合的原料藥材標(biāo)準(zhǔn)。本研究對血塞通原料藥材三七根莖的質(zhì)量進(jìn)行研究，以期形成符合血塞通特點(diǎn)的行業(yè)、團(tuán)體和企業(yè)內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)。

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

表3 各成分含有量測定結(jié)果Tab.3 Results of content determination of various constituents

在供試品溶液制備方面，2015 年版《中國藥典》 提取方法為靜置過夜，《美國草藥典》 為多次超聲、離心。本研究對比了2 種方法的提取率，結(jié)果顯示提取率相當(dāng)，后者更為方便、快速。

本研究采用了中國食品藥品檢定研究院提供的三七總皂苷對照品。該對照品經(jīng)中國食品藥品檢定研究院標(biāo)定，已明確三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rd 的含有量。該對照品用于注射用血塞通凍干的測定已經(jīng)過多年實(shí)踐檢驗(yàn)，相對于分別購買單標(biāo)再配制混標(biāo)更為經(jīng)濟(jì)、方便。

本研究對比了包括Phenomenex Kinetex C18100 ? （4.6 mm×100 mm，5 μm）、Agilent ZORBAX SB-Aq （4.6 mm×250 mm，5 μm）、Waters XBridge Shield RP18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Welch Ultimate AQ-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Waters XBridge C18（4.6 mm×250 mm，5 μm） 等在內(nèi)的多種色譜柱，以Waters XBridge C18（4.6 mm×250 mm，5 μm） 效果最優(yōu)。三七根莖化學(xué)成分的分離效果對色譜填料非常敏感，為確保結(jié)果的重現(xiàn)性和可比性，課題組建議在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定色譜柱型號。

本研究對色譜梯度洗脫程序進(jìn)行了大量的摸索與優(yōu)化。前20 min 采用等度洗脫，流動相A 的比例對人參皂苷Rg1與人參皂苷Re 的分離非常重要。為重現(xiàn)本方法，課題組建議實(shí)驗(yàn)人員根據(jù)自身實(shí)驗(yàn)條件，以19%A 為中心，以±1%為單位進(jìn)行逐步調(diào)整，以確保人參皂苷Rg1與人參皂苷Re 達(dá)到基線分離。另外，45 min 時(shí)A 的比例對人參皂苷Rb1及其附近色譜峰的分離尤為關(guān)鍵，0.5%的變化即可對分離效果造成較大影響。故建議以46%A 為中心，以±0.5%為單位進(jìn)行逐步調(diào)整，以尋求最佳的分離梯度。應(yīng)當(dāng)指出的是，三七中已分離鑒定的化合物數(shù)量超過200 個(gè)［14］，即使精制后的三七總皂苷的化學(xué)成分也非常復(fù)雜［15-16］，色譜圖中人參皂苷Rb1附近的色譜峰尤為豐富。盡管實(shí)驗(yàn)對分離條件進(jìn)行了細(xì)致的優(yōu)化，以目前常規(guī)一維HPLC 的分離能力，微量的共流出是難以避免的。有研究采用二維色譜［17］或液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)［18］進(jìn)行了探索，以降低共流出和基質(zhì)效應(yīng)對定量的干擾，使測定結(jié)果更加接近真實(shí)值。但特定且昂貴的儀器和對操作者要求制約了這些方法在工業(yè)界的推廣應(yīng)用。

根據(jù)本研究結(jié)果，將企業(yè)內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)暫定為藥材指紋圖譜相似度不得低于0.98。該方法指認(rèn)了占總峰面積90%以上的三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1和人參皂苷Rd 5 個(gè)主要共有峰，目前尚未對其他峰面積較小的色譜峰進(jìn)行指認(rèn)。在未來的工作中，課題組將以本研究建立的方法為工具，進(jìn)一步系統(tǒng)研究各成分在藥材、中間體、制劑間的轉(zhuǎn)移傳遞規(guī)律。

該方法在獲得指紋圖譜的同時(shí)可對三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1和人參皂苷Rd 5 種成分進(jìn)行含有量測定。15 批藥材5 種成分含有量得總和均高于13.0%。其中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb13 種成分總和均高于11.0%，遠(yuǎn)高于2015 年版《中國藥典》規(guī)定的5%，也高于ISO 標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的8%。根據(jù)本研究結(jié)果，將企業(yè)內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)暫定為藥材5 種成分含有量不得低于10%。在后續(xù)研究中，課題組將進(jìn)一步積累藥材含有量數(shù)據(jù)，以期為血塞通用三七根莖設(shè)定更為合理的含有量下限。