莊素琪張莉莉唐春萍沈志濱陳艷芬溫玉瑩侯 捷江 濤

（1.廣東藥科大學中藥學院，廣東 廣州510006； 2.廣東藥科大學實驗動物中心，廣州510006； 3.廣州市新藥篩選模型系統(tǒng)建設與應用重點實驗室，廣東 廣州510006； 4.廣東省局部精確給藥系統(tǒng)工程中心，廣東廣州510006）

皮膚癬菌是一種致病真菌，可侵入角質結構，感染、皮膚、毛發(fā)和指甲，表現(xiàn)為皮膚出現(xiàn)明顯化膿性滲出、結痂、潰瘍、角質化、毛囊炎及各種癬等［1］。近年來，由于貓、犬等寵物與人類接觸越發(fā)密切，皮膚癬菌病發(fā)病率急劇增加［2］。犬小孢子菌（Microsporum canis） 是皮膚癬菌最常見的致病菌之一，可引起犬皮膚真菌病和人體淺部真菌病，是重要的人獸共患病原菌［3］。目前臨床上對于皮膚癬菌所導致的疾病用藥仍以丙烯胺類、咪唑類等化學藥物為主，但隨著耐藥菌株的出現(xiàn)和耐藥率的逐年上升［4］，臨床上需要尋求新的抗M.canis藥物。

香鱗毛蕨Dryopteris fragrans（L.） Schott.為多年生蕨類植物，分布于我國東北、華北等地，且資源豐富。民間使用香鱗毛蕨作為藥用植物的歷史已有幾十年，現(xiàn)代研究證實了香鱗毛蕨對老年性皮膚瘙癢、各種皮膚病的治療效果顯著［5］，它被稱作“皮膚病的克星”。近年國內學者對香鱗毛蕨多有研究，主要圍繞其抗菌活性成分篩選，但關于其抗犬小孢子菌作用的研究和有效部位仍不十分明確。因此，本課題組前期初步探究了香鱗毛蕨有效部位體外抗M.canis的作用并對其進行成分分析。研究發(fā)現(xiàn)，香鱗毛蕨有效部位對M.canis有一定體外抑菌效果，其機制可能是通過影響麥角甾醇的合成或破壞細胞的完整性而實現(xiàn)［6］。經(jīng)高效液相色譜電噴霧四極桿飛行時間串聯(lián)質譜（HPLC-ESI-QTOFMS） 法測定，香鱗毛蕨有效部位的主要活性成分為14 種間苯三酚類衍生物［7］。前期研究僅有2 株標準菌株和1 株臨床菌株［6］，香鱗毛蕨有效部位對菌株的MIC 存在菌株依賴性［7］，新化合物的目標病原菌需多株臨床分離菌進行MIC 測定［8］，目前缺乏其對大量M.canis菌株數(shù)研究，并且仍未見香鱗毛蕨有效部位對M.canis的動態(tài)抗菌作用和體內抗菌作用研究報道。因此，本實驗通過瓊脂擴散法、試管藥基法和微量稀釋法評價香鱗毛蕨有效部位對12 株標準臨床菌株的的體外抗M.canis作用，采用時間-殺菌曲線法評價其動態(tài)抗M.canis作用；建立M.canis致豚鼠體癬模型，評價香鱗毛蕨有效部位的體內抗M.canis作用，以期為香鱗毛蕨進一步的研究提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 菌株 犬小孢子菌標準菌株4 株，編號分別為CMCC （F） M2C、CMCC （F） M3C、CMCC（F） M3d、CBS 113489，臨床分離菌株8 株，編號分別 為3219、5978、7855、5814、3586、6642、6178、7089 和近平滑念珠菌（編號ATCC22019）均購自中國醫(yī)學科學院南京皮膚病研究院。臨床菌株經(jīng)過Wood's 燈檢查和真菌培養(yǎng)等試驗［9］鑒定為M.canis。

1.2 動物 Hartley 普通級豚鼠90 只，雌性各半，體質量350～400 g。實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（粵） 2014-0035，合格證號44411600001444，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心。

1.3 藥物與試劑 香鱗毛蕨采自中國黑龍江省，經(jīng)哈爾濱商業(yè)大學張德連教授鑒定為鱗毛蕨科鱗毛蕨屬植物 （批號XLMJ-20171007）；硝酸咪康唑（純度＞99.2%，江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司，批號20170211）；氟康唑注射液（輝瑞制藥有限公司，批號A434403）；空白基質（廣東藥科大學中藥化學教研室，批號170708）；硝酸咪康唑（達克寧） ［20 g／支（每克含硝酸咪康唑0.02 g），西安楊森制藥有限公司，批號170309726］；氯化鈉（廣州化學試劑廠，批號20171004）；RPMI-1640（美國Gibco 公司，批號1786045）；PDA （青島海博生物技術有限公司，批號20171128）；青鏈霉素混合液（雙抗水） （北京索萊寶科技有限公司，批號20170718）。

1.4 儀器 血球計數(shù)板（上海市求精生化試劑儀器有限公司）；YXQ-LS-18SI 型手提式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博訊實業(yè)有限公司）；光學顯微鏡［麥克奧迪（廈門） 醫(yī)療診斷系統(tǒng)有限公司］；DHP-9032B 電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學儀器有限公司）；SW-CJ-1F 超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）。

2 方法

2.1 香鱗毛蕨有效部位體外抗M.canis作用的研究

2.1.1 香鱗毛蕨有效部位制備 取香鱗毛蕨地上部位經(jīng)乙醇提取和工藝富集純化后制得浸膏，其主要物質成分為間苯三酚類，經(jīng)紫外分光光度法測定，總間苯三酚質量分數(shù)58%［7］。取香鱗毛蕨有效部位浸膏1.890 g 溶于10 mL 95%乙醇中，配成質量濃度為189 mg／mL 的貯備液。實驗時再用培養(yǎng)基稀釋至所需濃度使用，使溶劑濃度≤1%。

2.1.2 菌懸液制備 參考文獻［6］ 關于M.canis的培養(yǎng)條件，將M.canis菌株用PDA 培養(yǎng)基于30℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育14 d，2 次傳代活化菌株。輕刮菌落并移至無菌研磨器中，加入0.85% 無菌生理鹽水1 mL，研磨。血球計數(shù)板計數(shù)將菌懸液濃度調至所需濃度。

2.1.3 瓊脂擴散法 香鱗毛蕨有效部位用95%乙醇稀釋成濃度為香鱗毛蕨有效部位高、中、低劑量（0.189、0.095、0.047 g／mL），設溶媒95% 乙醇作陰性對照組。按瓊脂擴散法［10］進行操作后于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育7～14 d，游標卡尺測量抑菌圈直徑。

2.1.4 試管藥基法 將香鱗毛蕨有效部位儲備液等比稀釋成8 個濃度梯度，范圍為23.525～0.184 mg／mL，硝酸咪康唑配制8 個濃度梯度，范圍為2.496～0.019 5 μg／mL。參照黃奕曦方法［11］制作含藥培養(yǎng)基、陽性對照（生長對照管） 和陰性對照（空白對照管），除空白對照管外，各試管分別加入1.0×106CFU／mLM.canis菌懸液50 μL，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，讀取MIC 值。將3 mL液體培養(yǎng)基倒入無菌落生長的含藥培養(yǎng)基試管斜面中，接種環(huán)輕刮培養(yǎng)基表面，充分振蕩后倒入無菌試管，于30 ℃孵育14 d，判讀MFC 值。

2.1.5 微量液基稀釋法 將香鱗毛蕨有效部位儲備液等比稀釋成10 個濃度梯度，香鱗毛蕨有效部位范圍為0.007 3～3.737 6 mg／mL，硝酸咪康唑配制10 個濃度組，范圍為0.019 5～9.984 μg／mL，按M38-A2 方案操作后將96 孔板置于35 ℃孵育5 d，進行MIC 判讀。同時使用質控藥物氟康唑對質控菌近平滑念珠菌（ATCC22019） 做質量控制，質控菌株MIC 在1～4 μg／mL 范圍內方可判斷試驗的可靠性。取判讀后大于MIC 的各孔中的液體100 μL，接種于PDA 固體培養(yǎng)基上，30 ℃繼續(xù)孵育14 d，判讀MFC 值。

2.2 時間-殺菌曲線 參考文獻［12］ 報道方法，并做稍微調整。1 800 μL 含藥培養(yǎng)基加入5×105CFU／mL 的CMCC （F） M3d 菌懸液200 μL，配制成5 組，即香鱗毛蕨有效部位低劑量組、中劑量組、高劑量組、硝酸咪康唑組及生長對照組（含RPMI-1640），于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)。培養(yǎng)0、2、4、8、12、24、48、72、96 h 取樣，樣品研磨成菌絲混懸液，稀釋10 倍后取20 μL 接種于PDA 培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)7 d，菌落計數(shù)法記錄菌落個數(shù)，計算菌液濃度。以時間為橫坐標，Log10CFU／mL 為縱坐標，繪制時間-殺菌曲線。實驗操作平行重復3 次。

2.3 香鱗毛蕨有效部位乳膏體內抗M.canis作用的研究

2.3.1 香鱗毛蕨有效部位乳膏的制備 取空白基質置于水浴鍋中，60 ℃水浴加熱熔化，加入適量香鱗毛蕨有效部位浸膏，攪拌均勻，冷凝至半固體狀態(tài)。分別按上述方法制備不同濃度香鱗毛蕨有效部位乳膏各100 g，濃度分別為0.189、0.094 5、0.047 3 g／g，避光密封保存，備用［13］。

2.3.2M.canis致豚鼠體癬模型的建立 Hartley豚鼠在實驗環(huán)境中飼養(yǎng)適應3 d。脫毛膏脫毛使之形成大小約4 cm×4 cm 的方形無毛區(qū)域。24 h 后用消毒并滅菌后的砂紙打磨至脫毛區(qū)點狀滲血。吸取1×108CFU／mL 的菌懸液0.2 mL，滴注于皮膚皮損滲血處，以無菌棉簽涂布均勻。接種7 d 后，參考文獻［14］，對每只豚鼠進行皮膚病變評分，無炎癥反應及鱗屑記0 分；少數(shù)丘疹，有細小鱗屑記1分；紅斑丘皰疹、紅斑融合，中等程度鱗屑記2分；紅斑丘疹或呈島狀散在，大量鱗屑記3 分；大量紅斑分布，鱗屑致密，局部出現(xiàn)糜爛甚至形成伴有出血記4 分。

2.3.3 分組及給藥 按皮損評分分值將實驗動物進行隨機分組，每組14 只，即模型組、硝酸咪康唑（達克寧） 陽性對照組、香鱗毛蕨有效部位低、中、高劑量組（0.047 3、0.094 5、0.189 g／g 香鱗毛蕨有效部位乳膏）。另設正常對照組14 只，不做任何處理。分組后涂抹相應藥物，每日早晚各涂1 次，每次涂乳膏約為0.4 g／只，連續(xù)用藥21 d。給藥第7、14、21 天對每只豚鼠病灶皮膚進行肉眼評分。

2.3.4 病原學檢查 豚鼠局部皮膚酒精消毒，刮取背部病灶少許鱗屑或拔取病灶部位毛發(fā)浸漬于配置好的雙抗水中2～3 min，在超凈臺中取出放置于含雙抗的沙氏培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿放入30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察其菌落生長狀況和形態(tài)。若無菌落生長，則記為陰性，若有菌落生長則記為陽性［13］。真菌學轉菌學＝ （每組培養(yǎng)陰性數(shù)／每組感染動物總數(shù)） ×100%。

2.3.5 組織病理學檢查 分組給藥第7、14 天各組隨機取2 只豚鼠處死；21 d 后各組豚鼠全部處死，用75%酒精消毒處死的豚鼠背部感染區(qū)皮膚，每只剪下1.5 cm×1.5 cm 的方形皮損，放置75%乙醇中浸泡2～3 min，經(jīng)無菌生理鹽水洗凈后，用中性甲醛固定，制備病理切片，進行PAS 染色觀察皮膚組織中的真菌菌絲及孢子。

2.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 22 統(tǒng)計軟件進行分析，各組間皮膚病變學評分比較采用方差分析，各組間轉陰率比較采用卡方檢驗，P≤0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 香鱗毛蕨有效部位對M.canis抑菌圈的影響 從表1 可見，溶劑對照組無明顯抑菌圈，與溶劑對照組比較，香鱗毛蕨有效部位不同濃度對犬小孢子菌產(chǎn)生不同大小的抑菌圈，濃度越高，抑菌圈直徑越大。

表1 抑菌圈直徑（， n＝3）Tab.1 Sizes of inhibition zone （， n＝3）

表1 抑菌圈直徑（， n＝3）Tab.1 Sizes of inhibition zone （， n＝3）

注：“—”表示無抑菌圈。

3.2 試管藥基法測定香鱗毛蕨有效部位對M.canis的MIC 和MFC 的影響 空白培養(yǎng)基對照管無菌落生長，生長對照管菌落生長良好。如表2 所示，香鱗毛蕨有效部位對12 株M.canisMIC 范圍為0.185～1.477 mg／mL，MFC 范圍為0.369～2.954 mg／mL。硝酸咪康唑對12 株M.canis的MIC 和MFC 范圍都為0.156～1.25 μg／mL。

3.3 微量稀釋法測定香鱗毛蕨有效部位對M.canis的MIC 和MFC 值的影響 實驗平行條件操作下，氟康唑對質控菌株的MIC 值為1～4 μg／mL，符合CLSI M38-A2 標準。香鱗毛蕨有效部位對12株M.canis的MIC 范圍為0.157 4～1.26 mg／mL，MFC 范圍為0.472 5～1.89 mg／mL；硝酸咪康唑對12 株M.canis的 MIC 范圍為 0.312 5～0.625 μg／mL，MFC 范圍為0.312 5～1.25 μg／mL。見表3。

表2 試管藥基法測定MIC 和MFC 值（n＝3）Tab.2 MIC and MFC values by tube dilution method（n＝3）

表3 微量稀釋法測定MIC 和MFC 值（n＝3）Tab.3 The MIC and MFC values by microdilution method（n＝3）

3.4 香鱗毛蕨有效部位對M.canis時間-殺菌曲線的影響 由圖1 可見，生長對照組菌落數(shù)濃度在4、8 h 有下降趨勢，12 h 后持續(xù)增長。香鱗毛蕨有效部位低劑量組24 h 前菌落計數(shù)濃度有降低趨勢，48 h 后小趨勢上升，但與生長對照組相比上升不明顯。硝酸咪康唑組及香鱗毛蕨有效部位中劑量組菌落計數(shù)濃度持續(xù)降低，但直到96 h 仍有菌落生長。香鱗毛蕨有效部位高劑量組下降趨勢明顯，72 h 時平皿培養(yǎng)基上已無菌落生長，與起始接種量比，菌液濃度減少達到99.9%，能完全殺死M.canis。

圖1 各組時間-殺菌曲線圖Fig.1 Time-fungicidal curve of each group

3.5 香鱗毛蕨有效部位乳膏體內抗M.canis作用的研究

3.5.1 香鱗毛蕨有效部位乳膏對豚鼠皮膚病變評分的影響 各皮損評分值所代表的情況見圖2，各組皮膚病變評分見表4。豚鼠感染M.canis第8 天出現(xiàn)紅斑丘疹融合，大量鱗屑致密布滿病灶部位，此時開始給藥治療。給藥第14、21 天，與模型組比較，各給藥 組病變 評分下 降 （P＜0.05，P＜0.01）。

圖2 各皮損分值代表的情況Fig.2 Situation revealed by the score of each skin lesion

表4 各組豚鼠皮損評分（， n＝10）Tab.4 Skin lesion score of guinea pigs in each group （， n＝10）

表4 各組豚鼠皮損評分（， n＝10）Tab.4 Skin lesion score of guinea pigs in each group （， n＝10）

注：與模型組比較，?P＜0.05，??P＜0.01。

3.5.2 香鱗毛蕨有效部位乳膏對豚鼠感染模型真菌學轉陰率的影響 由表5 可見，給藥第7 天，與模型組相比，各給藥組真菌學轉陰率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；第14 天，咪康唑組、香鱗毛蕨有效部位乳膏高劑量組真菌轉陰率升高（P＜0.05）；第21 天，各給藥組真菌轉陰率均升高（P＜0.05，P＜0.01）。

表5 各組豚鼠真菌學轉陰率（n＝10）Tab.5 Negative fungal conversion rates of guinea pigs in each group （n＝10）

3.5.3 香鱗毛蕨有效部位乳膏對豚鼠病變組織病理學的影響 給藥7 d，各組皮膚角質層內和毛囊內仍見大量孢子與菌絲；給藥14 d，各給藥組皮膚組織中孢子與菌絲減少，香鱗毛蕨有效部位高劑量組基本不見菌絲和孢子；給藥21 d，模型組皮膚組織中仍見孢子與菌絲，而各給藥組基本無明顯孢子與菌絲。見圖3。

4 討論

近年來，隨著人們生活水平的提高和生活方式的改變，寵物熱不斷上升，M.canis所致真菌病的發(fā)病率日益升高，且其傳染性強，一定條件下可在特定人群引起泛發(fā)性淺部真菌?。?5］。常用的許多抗真菌藥有一定的不良反應，且菌株耐藥現(xiàn)象日益嚴重。因此，迫切需要進一步加強抗M.canis新型抗菌藥物的篩選、研發(fā)，中藥抗真菌藥物具有廣闊的研發(fā)前景。

圖3 各組皮膚組織PAS 染色（×100）Fig.3 PAS staining of skin tissue in each group （× 100）

目前關于中藥對M.canis的體外抗菌作用研究［6-7］已逐漸增多，但中藥化學成分復雜，影響體外抑菌試驗結果判定因素較多［16］。為提高試驗結果的準確度和可信度，本研究采用試管藥基法和美國臨床實驗室標準委員會（CLSI） 推出的M38-A2方法測定香鱗毛蕨有效部位對12 株M.canis的MIC 和MFC 值，結果表明香鱗毛蕨有效部位對12株M.canis均有一定的抑菌和殺菌作用。另外，時間-殺菌曲線法可反映藥物抗真菌活性的速度和程度隨時間變化的過程，為確定藥物濃度與時效研究提供重要的依據(jù)［17］。研究結果表明，隨著藥物濃度的升高，香鱗毛蕨有效部位對M.canis的抑制作用增大，起效時間縮短，香鱗毛蕨有效部位高劑量組有明顯殺菌作用，以上結果提示香鱗毛蕨有效部位對M.canis的抑制作用呈劑量依賴性。

在中藥抗菌藥物研究中，體內外抗菌實驗結果并不完全一致［16］，因此建立體內動物模型極其重要。本研究 參照金 星姬等［14］的報道，采 用1×108CFU／mL 的菌液濃度接種感染，選擇了M.canis標準株CMCC （F） M3d 建立了豚鼠體癬模型。由于目前并無統(tǒng)一的M.canis致動物感染評分標準，本研究參考皮膚癬菌相關文獻［13］，以皮損評分、真菌學轉陰率和組織病理形態(tài)學來綜合評價香鱗毛蕨有效部位對M.canis致豚鼠體癬模型的療效。研究結果表明香鱗毛蕨有效部位可顯著減輕豚鼠皮膚病變程度，提高真菌學轉陰率，減少PAS染色的孢子數(shù)和菌絲數(shù)。以上研究提示香鱗毛蕨有效部位體內抗M.canis效果良好，并具有一定的量效關系。

本實驗采用體外多種方法和體內M.canis致豚鼠體癬模型評價香鱗毛蕨有效部位對M.canis的抗菌作用，證實了香鱗毛蕨有效部位對M.canis有一定抑菌和殺菌作用，以期為治療M.canis引起的皮膚癬菌病的研究和香鱗毛蕨的開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。但本研究仍存在一定的不足，香鱗毛蕨有效部位抗M.canis的機制還有待進一步研究。