邵福平阮 旭李夢穎張孟孟楊 曄 尹登科

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥230012； 2.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院藥物制劑研究所，安徽 合肥230012； 3.中藥復(fù)方安徽省重點實驗室，安徽 合肥230012）

糖尿病腎病是導(dǎo)致終末期腎病的主要原因，在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展過程中，近端小管發(fā)揮了重要作用［1］。近端小管驅(qū)動的炎性反應(yīng)，不僅會誘導(dǎo)腎小管間質(zhì)纖維化和腎小管萎縮，還可能引發(fā)腎小球硬化［2］。腎內(nèi)腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）的激活與糖尿病腎病密切相關(guān)［3］，腎小管血管緊張素Ⅱ受體1 （AT1） 途徑的激活會導(dǎo)致促炎介質(zhì)的產(chǎn)生，細(xì)胞內(nèi)外所形成的活性氧會進一步誘導(dǎo)腎損傷［4］。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（ACEI） 和血管緊張素Ⅱ受體Ⅰ阻斷劑（ARB） 可減輕糖尿病腎?。?-6］。但是這些藥物療效仍然有限，無法阻止糖尿病腎病繼續(xù)發(fā)展為終末期器官衰竭［7］。臨床上已有報道采用丹參注射液聯(lián)合替米沙坦治療糖尿病腎病，結(jié)果表明丹參注射液和替米沙坦對糖尿病腎病患者具有良好的協(xié)同作用［8］。本課題組前期已經(jīng)證明丹參注射液可以改善腎小管的結(jié)構(gòu)和功能［9］，但是對糖尿病腎小管的RAS 是否有影響尚不清楚。因此，本課題考察了丹參注射液對高糖誘導(dǎo)的NRK-52E 細(xì)胞以及糖尿病大鼠腎小管AT1 表達(dá)的影響。

1 材料

1.1 細(xì)胞株 NRK-52E 細(xì)胞購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（武漢）。

1.2 動物 SPF 級SD 大鼠購自安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心［動物生產(chǎn)許可證號SCXK （皖） 2017-001］，體質(zhì)量100～140 g，雄性，所有動物均在25 ℃下飼養(yǎng)。大鼠可以自由獲得標(biāo)準(zhǔn)的嚙齒動物飲食和飲用水。所有動物實驗均按照安徽中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會指南進行。

1.3 藥物與試劑 丹參注射液（中國杭州正大青春寶藥業(yè)有限公司，批號1705083，生藥質(zhì)量濃度1.5 g／mL）；鏈脲佐菌素（STZ，美國Sigma 公司，批號LS0130）；AT1 抗體（美國Abbkine 公司，批號ATQJN2001）；BCA 蛋白質(zhì)檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號P0012S）；RIPA 裂解液（北京索萊寶科技有限公司，批號R0020）；PV-6000 （北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號1919D0301）。

1.4 儀器 安穩(wěn)免調(diào)碼型血糖儀和血糖試紙條（三諾傳感股份有限公司，批號820728）；高效液相色譜儀 （美國Waters 公司）；SPECTRA MAX-190 型酶標(biāo)儀（美國MDC 公司）；倒置生物顯微鏡（德國Leica 公司）；DYCZ-24DN 型垂直電泳儀（北京六一儀器廠）；Amersham Imager 600 成像儀（美國GE 公司）；Hitachi 7600 自動生化分析儀（日本Hitachi 公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) NRK-52E 細(xì)胞在37 ℃，含有5%CO2的潮濕空氣下，采用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)。將細(xì)胞以1×106／孔接種于6 孔板中，培 養(yǎng) 24 h，將細(xì)胞 分為正常組（5.5 mmol／L 葡萄糖）、模型組（80 mmol／L 葡萄糖）、丹參注射液組（60、120、240 μg／mL）、氯沙坦組（1×10-5mol／L 氯沙坦）。各組細(xì)胞分別采用相應(yīng)藥物處理24 h 后，收集細(xì)胞，-20 ℃保存。

2.2 糖尿病大鼠模型制備及給藥 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，隨機分為正常組、模型組、丹參注射液組、氯沙坦組。大鼠每日采用高脂飼料（HFD，蔗糖-豬油-奶粉-雞蛋-一般飼料＝30 ∶20 ∶4 ∶2 ∶63） 喂養(yǎng)，其中正常組以正常飼料喂養(yǎng)。喂養(yǎng)2周后，腹腔注射STZ 溶液（50 mg／kg） 到高脂飼料喂養(yǎng)的大鼠體內(nèi)，以10 mmol／L 檸檬酸鹽緩沖液（pH＝4.5） 為溶劑制備STZ 溶液。3 d 后，測定大鼠血糖濃度，當(dāng)血糖濃度≥16.7 mmol／L 時，可被認(rèn)定為造模成功。丹參注射液組腹腔注射丹參注射液（2 mL／kg），氯沙坦組灌胃氯沙坦（20 mg／kg）。模型組和正常組大鼠分別每天腹腔注射2 mL／kg 生理鹽水，每周及時記錄各大鼠血糖水平。給藥6 周后，使用潔凈的代謝籠收集每只大鼠的尿液，并從腹主動脈收集血液樣品。大鼠處死后，摘除腎臟浸泡在10% 福爾馬林中固定過夜，脫水，包埋，制成蠟塊。石蠟切片厚度為5 μm，用于后續(xù)HE 染色和免疫組織化學(xué)檢測。

2.3 腎功能的生化指標(biāo)檢測 用血糖儀測定血糖。通過Hitachi 7600 自動生化分析儀測定血清肌酐（Scr）、血尿素氮（BUN）、血漿甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC），并通過將尿蛋白濃度與24 h 尿量相乘來計算24 h 尿蛋白排泄。根據(jù)制造商提供的方案，使用BCA 蛋白質(zhì)測定試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。

2.4 腎組織中AT1 表達(dá)檢測 采用免疫組化。腎組織切片進行AT1 免疫組化染色以評估丹參注射液對RAS 的影響。首先，采用PBS （10 mmol／L，pH＝7.2） 洗滌3 次，5 min／次，然后用3% H2O2處理切片5 min，將處理后的切片浸入煮沸的檸檬酸鹽緩沖溶液 （10 mmol／L，pH ＝6.0） 10～15 min。然后在室溫下用5% 牛血清白蛋白封閉30 min，加入一抗AT1 在4 ℃溫育過夜。次日，用PBS 重復(fù)洗滌3 次，根據(jù)制造商的說明將切片在聚合物檢測系統(tǒng)試劑盒中孵育20 min，并通過DAB顯色液顯色，再采用蘇木精進行細(xì)胞核染色，通過脫水，透明化和固定等步驟后，甘油封片，拍照，每組隨機選擇20 個視野，采用Image J 軟件分析陽性表達(dá)值。

2.5 腎組織及NRK-52E 細(xì)胞AT1 表達(dá)檢測 采用Western blot 法。RIPA 裂解液裂解細(xì)胞或腎組織，將裂解物離心并收集上清液。用BCA 蛋白質(zhì)測定試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。用SDS-PAGE 分離蛋白質(zhì)（50 μg），然后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，用5% 脫脂奶粉（含Tween-20 的Tris 緩沖鹽溶液配制） 在室溫下封閉1 min，然后孵育一抗，4 ℃過夜。次日洗滌后，加入二抗在37 ℃溫育1 min。以β-actin 為內(nèi)參，使用凝膠成像儀檢測蛋白質(zhì)條帶。用Image J 軟件分析條帶強度。每組條帶以正常組AT1／βactin 比值為1，其它組與之進行比較從而對各組AT1 表達(dá)進行后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

2.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 17.0 軟件進行分析，數(shù)據(jù)以（） 表示。多組間比較采用單因素方差分析。以P≤0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 丹參注射液對高糖誘導(dǎo)的NRK-52E 細(xì)胞AT1蛋白表達(dá)的影響 與正常組比較，高糖刺激24 h后，NRK-52E 細(xì)胞AT1 蛋白表達(dá)增加（P＜0.01）；與高糖 組比較，丹參注 射液組 （120、240 μg／mL）、氯沙坦可以抑制高糖誘導(dǎo)的NRK-52E 細(xì)胞AT1 蛋白表達(dá)（P＜0.01）。見圖1。

圖1 丹參注射液對高糖誘導(dǎo)的NRK-52E 細(xì)胞AT1 蛋白表達(dá)的影響（n＝3）Fig.1 Effects of Danshen Injection on AT1 expression in high glucose-induced NRK-52E （n＝3）

3.2 丹參注射液對糖尿病大鼠蛋白尿水平及腎功能指標(biāo)的影響 與正常組比較，模型組大鼠血糖、血漿TG、TC、24 h 尿蛋白排泄、Scr 和BUN 水平升高（P＜0.01），但體質(zhì)量降低（P＜0.01）。給藥6 周后，與模型組比較，氯沙坦組大鼠24 h 尿蛋白排泄、Scr 和BUN 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），丹參注射液組鼠血漿TG、TC、24 h 尿蛋白排泄、Scr 和BUN 水平降低（P＜0.01），氯沙坦組和丹參注射液組對大鼠血糖差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 丹參注射液對糖尿病大鼠蛋白尿及腎功能指標(biāo)的影響（n＝6～8）Tab.1 Effects of Danshen Injection on proteinuria and renal function of diabetic rats （n＝6-8）

3.3 丹參注射液對糖尿病大鼠腎組織形態(tài)及AT1 蛋白表達(dá)的影響 如圖2 所示，正常腎臟中，每個腎小球由填充毛細(xì)血管的花瓣狀分支系統(tǒng)組成，在血管內(nèi)皮細(xì)胞和系膜細(xì)胞中沒有發(fā)現(xiàn)肥大或增生，無炎性細(xì)胞浸潤，基底膜也未呈現(xiàn)增厚和纖維性肥大；同時正常腎小管中，腎小管上皮細(xì)胞沒有壞死，管腔中沒有外來顆粒。模型組腎小球中出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤，系膜細(xì)胞增生，毛細(xì)血管收縮和變窄，基底膜增厚和纖維化的現(xiàn)象，同時周圍伴隨有腎小管間質(zhì)纖維化。丹參注射液治療后，糖尿病大鼠腎小球和皮質(zhì)的結(jié)構(gòu)形態(tài)與正常組大鼠相似，腎小球系膜細(xì)胞增殖明顯減少，皮質(zhì)腎小管肥大、擴張，基底膜增厚情況也顯著緩解。免疫組化與Western blot 結(jié)果顯示與正常組比較，模型組腎小管中AT1 蛋白表達(dá)增加（P＜0.01）。經(jīng)丹參注射液治療6 周后，丹參注射液AT1 蛋白表達(dá)下降（P＜0.05，P＜0.01），見圖2～3。

圖2 丹參注射液對糖尿病大鼠腎組織形態(tài)及AT1 蛋白表達(dá)的影響（n＝20）Fig.2 Effects of Danshen Injection on morphology and AT1 protein expression of renal tissue in diabetic rats （n＝20）

圖3 丹參注射液對糖尿病大鼠腎組織AT1 蛋白表達(dá)的影響（n＝3）Fig.3 Effects of Danshen Injection on AT1 protein expression of renal tissue in diabetic rats （n＝3）

4 討論

糖尿病腎病的典型癥狀是尿蛋白排泄增加，而尿蛋白水平的高低與進展與終末期腎病和心血管疾病的風(fēng)險分級增加有關(guān)［10］，高脂血癥也是發(fā)展為糖尿病性腎病的一種風(fēng)險因素。因此，高脂飼料喂養(yǎng)大鼠并腹腔注射STZ 通常被用于構(gòu)建糖尿病模型。模型組大鼠的24 h 尿蛋白排泄，BUN 和Scr水平顯著高于正常組，并且在6 周后部分萎縮性小管出現(xiàn)空泡化和狹窄的管腔，具有無序小管上皮細(xì)胞。丹參注射液治療6 周后，糖尿病大鼠24 h 尿蛋白排泄量和腎功能指數(shù)顯著降低，平衡血脂異常，但不影響血糖水平，與先前的報道一致［11］。HE 染色顯示，丹參注射液組大鼠皮質(zhì)腎小管基底膜的肥厚，擴張情況有所改善。因此，降低血脂可能是丹參注射液對糖尿病腎病的治療作用之一。

RAS 是重要的體液調(diào)節(jié)系統(tǒng)，其廣泛地存在于機體組織中，如心臟、腎臟、血管壁等。在體內(nèi)，當(dāng)RAS 激活時，血管緊張素原在腎素的催化下轉(zhuǎn)化為血管緊張素Ⅰ（Ang Ⅰ），而后又在ACE的關(guān)鍵作用下轉(zhuǎn)化為血管緊張素Ⅱ（Ang Ⅱ），該系統(tǒng)可參與調(diào)節(jié)腎小球與腎小管之間的平衡，降低腎小球濾過壓，影響腎血容量、血壓等［12］。近期有研究［13］表明，RAS 是糖尿病腎病主要發(fā)病機制之一，同時由于近端腎小管功能主要是通過循環(huán)和旁路分泌的Ang Ⅱ進行調(diào)節(jié)［14-15］，并且在患病狀態(tài)下誘導(dǎo)鈉潴留和腎小管-間質(zhì)損傷或纖維化［16］，所以近端腎小管是腎臟中RAS 的主要靶組織之一。本研究發(fā)現(xiàn)體外高糖誘導(dǎo)的NRK-52E 細(xì)胞以及體內(nèi)糖尿病大鼠皮質(zhì)腎小管中的AT1 表達(dá)均與之前的報道一致［17］。研究表明，丹參注射液可以有效抑制高糖誘導(dǎo)的NRK-52E 細(xì)胞以及糖尿病大鼠腎小管中AT1 的表達(dá)，改善糖尿病大鼠腎臟病變及腎功能。盡管目前還沒有發(fā)現(xiàn)有關(guān)丹參是AT1 拮抗劑的報道，但是已有許多文獻(xiàn)表明丹參注射劑［18-19］或丹參中活性化合物［20-21］減弱了Ang Ⅱ誘導(dǎo)的腎臟損傷。所以丹參干預(yù)RAS 作用可能是改善糖尿病腎病作用機制之一。