黃海潮，何 欣，周 捷?，聶 陽，趙 晉，徐單單

（1.廣東食品藥品職業(yè)學院，廣東 廣州510520； 2.中山大學腫瘤防治中心，廣東 廣州510060； 3.廣東醫(yī)科大學，廣東 東莞523808）

甘木通為毛茛科絲鐵線蓮Clematis filamentosaDunn.屬，其葉及根入藥，有活血通脈降壓、鎮(zhèn)靜安神之功效［1］。甘木通主要分布于嶺南地區(qū)，為華南珍稀藥材，臨床用于冠心病、心絞痛、心肌梗死等心血管疾病治療。目前對于甘木通的研究報道集中于其成分提取以及其治療心血管疾病作用及機制，對其在神經(jīng)退行性疾病中的作用鮮見報道。

缺血性腦卒中又稱為腦梗死，其患病率、死亡率、復發(fā)率、致殘率高［2］。中醫(yī)學關于腦梗死主要病位證素分析結合肝陽上亢證、風火閉竅證、痰火閉竅證等病證分析［3］，而甘木通可用于肝經(jīng)有熱、肝陽上亢、脈絡瘀阻等相關疾病治療前期實驗研究［4］表明，甘木通能有效降低氧化應激引起的神經(jīng)損傷，提示其在神經(jīng)退行性疾病中的潛在治療作用，設想其對于腦中風防治有一定的作用。

缺血性腦卒中發(fā)病機制為血管堵塞造成腦血流量減少，導致腦組織缺血缺氧，引起組織損傷。本研究通過模擬腦缺血病理生理發(fā)展過程，以PC12細胞建立體外缺血性中風的細胞模型，研究甘木通乙酸乙酯提取物（ethyl acetate extract fromClematis filamentosaDunn.EAECFD） 對缺血性中風的影響及作用機制。

1 材料

1.1 細胞株 大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞（PC12細胞，中國醫(yī)學科學院上海細胞研究所）。

1.2 藥物與試劑 甘木通（批號120618，廣東康美藥業(yè)股份有限公司），經(jīng)廣東食品藥品職業(yè)學院聶陽副主任藥師鑒定為正品；DMEM 培養(yǎng)基、馬血清（美國Gibco 公司）；胎牛血清（FBS，批號140313，杭州四季青生物工程材料有限公司）；胰蛋白酶（批號2014B015，美國Amresco 公司）；CCK-8 試劑盒［批號GH802，東仁化學科技（上海） 有限公司］；Triton-X、二甲基亞砜（DMSO） （美國Sigma公司）；PBS （pH ＝7.2，杭州吉諾生物醫(yī)藥技術有限公司）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA） 試劑盒（南京建成生物工程研究所）；BCA 法蛋白定量試劑盒、AnnexinⅤ-FITC／PI 細胞凋亡檢測試劑盒、線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1） （上海碧云天生物技術有限公司）；B 淋巴細胞瘤-2 蛋白（Bcl-2）、Bcl-2相關X 蛋白（Bax）、β-actin、活化型半胱天冬酶-3（cleaved caspase-3） （美國CST 公司）；其他試劑均為分析純。

1.3 儀器 311 型細胞培養(yǎng)箱、Sorvall ST 40 臺式離心機（美國Thermo 公司）；DMIL 熒光倒置顯微鏡（德國Leica 公司）；Microplate Reader 酶標儀（美國Bio-Tek 公司）；BD FACS Verse 流式細胞儀（美國BD 公司）。

2 方法

2.1 甘木通乙酸乙酯提取物制備 取甘木通干燥粉碎，過30 目篩，參考文獻［5］ 進行初提取，得初提液，蒸干；用乙酸乙酯再提取，大孔樹脂純化提取液，得洗脫液并干燥至恒定質(zhì)量，提取物得率為1.01%；所得提取物用DMEM 培養(yǎng)液超聲溶解，經(jīng)無菌濾膜過濾備用。

2.2 細胞培養(yǎng) PC12 細胞用含有10% FBS 和5%馬血清的DMEM 培養(yǎng)基（pH＝7.4） 培養(yǎng)，放置于培養(yǎng)條件為95%空氣、5% CO2、37 ℃細胞培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)24 h 換液1 次，待細胞生長覆蓋約至80%，用胰酶消化傳代，培養(yǎng)于培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶內(nèi)貼壁待用，于實驗前12 h 更換成無血清低糖DMEM 培養(yǎng)基。

2.3 缺氧細胞模型構建 取實驗待用細胞，根據(jù)參考文獻［6］ 方法模擬腦中風缺氧復氧模型。將細胞置于95% N2、5% CO2、37 ℃密閉容器中，培養(yǎng)0.5、1、2、4、8、12、24 h；再將細胞置于37 ℃、飽和濕度、95% 空氣、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)0.5 h；然后加入10 μL CCK-8 檢測試劑，37 ℃溫育2 h，同時設置正常細胞對照組，酶標儀測定450 nm 處吸光度（OD）。細胞存活率＝ （OD實驗組／OD對照組） ×100%。根據(jù)試驗結果選擇合適的缺氧時間制作缺氧模型。

2.4 甘木通乙酸乙酯提取物對缺氧PC12 細胞活性的影響 取實驗待用細胞，根據(jù)前期實驗結果［4］選擇提取物濃度，分為對照組，模型組（缺氧4 h），甘木通提取物高、中、低劑量組（100、50、25 μg／mL），陽性對照組（尼莫地平）。通過CCK-8檢測細胞存活率，酶標儀測定450 nm 處吸光度（OD），計算細胞存活率。

2.5 甘木通乙酸乙酯提取物對缺氧PC12 細胞LDH 漏出的影響 根據(jù)“2.4” 項下實驗分組處理細胞，根據(jù)LDH 試劑盒操作說明處理細胞，并測定各組細 胞吸光 度 （OD）。LDH 漏出率＝（OD實驗組／OD模型組） ×100%。

2.6 甘木通乙酸乙酯提取物對缺氧PC12 細胞凋亡的影響 將PC12 細胞接種于6 孔板中，按“2.4” 項下分組處理細胞，小心吸去原培養(yǎng)液，用PBS 輕輕沖洗，胰酶消化，收集細胞懸液，以1 000 r／min離心10 min，棄去上清，根據(jù)試劑盒提供的步驟進行Annexin V-FITC／PI 染色，流式細胞儀檢測不同分組PC12 細胞的凋亡率。將PC12 細胞接種于6 孔板中，小心吸去原培養(yǎng)液后，用PBS洗滌后，加入4%多聚甲醛固定15 min 后，PBS 沖洗，Hoechst 33258 染色，在熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡形態(tài)。

2.7 甘木通乙酸乙酯提取物對缺氧PC12 細胞線粒體膜電位的影響 按“2.4” 項下分組處理后，收集細胞制成細胞懸液，調(diào)節(jié)細胞數(shù)至2×105個，根據(jù)試劑盒說明操作，染色，采用流式細胞儀檢測。

2.8 甘木通乙酸乙酯提取物對缺氧PC12 細胞凋亡蛋白表達的影響 將PC12 細胞接種于6 孔板中，按“2.4” 項下分組處理后，用冰冷的PBS 沖洗2 次，收集細胞并冰凍裂解，12 000 r／min 離心15 min 去除雜質(zhì)，吸取上清液，BCA 法測定蛋白量。用含12% SDS-PAGE 膠分離總蛋白，然后轉移PVDF 膜 上，5% BSA 封 閉90 min，加入一 抗（Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3），冰凍孵育過夜。洗膜后，加入二抗，37 ℃孵育1 h，再洗1 遍，觀察各蛋白表達量并與內(nèi)參（β-actin） 作比較。

2.9 甘木通乙酸乙酯提取物對缺氧PC12 細胞SOD、MDA 水平的影響 將PC12 細胞接種于24孔板中，按“2.4” 項下分組處理后，去除原培養(yǎng)液，根據(jù)參考文獻［7］方法處理后，按說明書測定細胞中SOD 和MDA 水平。

2.10 統(tǒng)計學分析 利用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以（） 表示，多組間比較采用方差分析，以P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 不同缺氧時間對PC12 細胞存活率的影響 隨著缺氧時間的增加，PC12 細胞存活率逐漸下降。與對照組（缺氧0 h） 比較，PC12 細胞缺氧2～24 h 細胞存活率降低（P＜0.05，P＜0.01），見圖1。本實驗缺氧造模時間設為4 h。見圖1。

3.2 甘木通乙酸乙酯提取物對缺氧PC12 細胞存活率的影響 與模型組比較，甘木通乙酸乙酯提取物提高細胞存活率（P＜0.05，P＜0.01），見圖2。

3.3 甘木通乙酸乙酯提取物對缺氧PC12 細胞LDH 漏出的影響 在缺氧條件下，細胞中LDH 漏出率增加（P＜0.01）。與模型組比較，甘木通乙酸乙酯提取物能降低 LDH 漏出率 （P＜0.05，P＜0.01），表明甘木通乙酸乙酯提取物對缺氧誘導的細胞損傷有保護作用。見圖3。

圖1 不同缺氧時間對PC12 細胞存活率的影響（n＝6）Fig.1 Effects of different hypoxic time on PC12 cell survival rate （n＝6）

圖2 甘木通乙酸乙酯提取物對缺氧PC12 細胞存活的影響（n＝6）Fig.2 Effects of EAECFD on the survival of hypoxic PC12 Cells （n＝6）

3.4 甘木通乙酸乙酯提取物對缺氧PC12 細胞凋亡的影響 流式細胞術結果顯示，對照組細胞凋亡很少，凋亡率為6.8%；模型組細胞凋亡數(shù)量增多，凋亡率為46.3%，并且有部分細胞壞死；陽性對照組細胞凋亡率為11.3%；不同質(zhì)量濃度甘木通乙酸乙酯提取物作用，凋亡細胞比例逐漸減少，細胞凋亡率分別為39.6%、27.8%、15.5%，見圖4。Hoechst 33258 染色結果顯示，對照組細胞核形態(tài)完整，基本沒有凋亡細胞少；模型組出現(xiàn)多處亮色熒光，表明細胞凋亡形態(tài)明顯；陽性對照組細胞基本趨于正常；甘木通乙酸乙酯提取物組正常細胞增多，見圖5。

圖5 Hoechst 33258 染色觀察各組細胞凋亡細胞形態(tài)（×400）Fig.5 Apoptotic cell morphology by Hoechst 33258 staining （×400）

3.5 甘木通乙酸乙酯提取物對缺氧PC12 細胞線粒體膜電位的影響 與對照組比較，模型組細胞的線粒體膜電位下降（P＜0.01）；與模型組比較，甘木通乙酸乙酯提取物中、高劑量組及陽性對照組線粒體膜電位升高（P＜0.05，P＜0.01）。見圖6。

3.6 甘木通乙酸乙酯提取物對缺氧PC12 細胞凋亡蛋白表達的影響 Bcl-2、Bax 蛋白表達影響線粒體膜的通透性，從而啟動線粒體凋亡信號通路［8］。cleaved caspase-3 是caspase-3 的活化形式，其決定細胞凋亡程度［9］。與對照組比較，模型組Bcl-2 蛋白表達降低，Bax／Bcl-2 比例及Bax、cleaved caspase-3 蛋白表達增加（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，甘木通乙酸乙酯提取物組（中、高劑量） Bcl-2 蛋白表達增加，Bax／Bcl-2 比例及Bax、cleaved caspase-3蛋白表達降低（P＜0.05，P＜0.01），見表1、圖7。

圖6 甘木通乙酸乙酯提取物對缺氧PC12 細胞線粒體膜電位的影響（n＝3）Fig.6 Effects of EAECFD on mitochondrial membrane potential in hypoxic PC12 cells （n＝3）

表1 甘木通乙酸乙酯提取物對缺氧PC12 細胞凋亡蛋白表達的影響（%，， n＝3）Tab.1 Effects of EAECFD on the expression of Bax，Bcl-2 and cleaved caspase-3 in hypoxic PC12 cells （%，， n＝3）

表1 甘木通乙酸乙酯提取物對缺氧PC12 細胞凋亡蛋白表達的影響（%，， n＝3）Tab.1 Effects of EAECFD on the expression of Bax，Bcl-2 and cleaved caspase-3 in hypoxic PC12 cells （%，， n＝3）

注：與對照組相比，?P＜0.05，??P＜0.01；與模型組相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

圖7 Western blot 檢測凋亡蛋白表達Fig.7 Apoptosis-related proteins expression by Western blot

3.7 甘木通乙酸乙酯提取物對缺氧PC12 細胞SOD、MDA 水平的影響 與對照組比較，模型組SOD 水平降低，MDA 水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，甘木通乙酸乙酯提取物組SOD 水平升高，MDA 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），見圖8。

4 討論

圖8 甘木通乙酸乙酯提取物對缺氧PC12 細胞SOD、MDA 水平的影響（n＝6）Fig.8 Effects of EAECFD on SOD，MDA levels of hypoxic PC12 cells （n＝6）

近年來研究［10］表明，腦中風的病理生理機制為各種因素引起的神經(jīng)元的凋亡以及壞死，導致神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)不可逆的損傷，從而使中風加深加重。本實驗根據(jù)缺血性中風導致神經(jīng)系統(tǒng)的缺氧／復氧的病理機制，建立缺血性中風的細胞模型。該模型更能真實的模擬缺血缺氧的病理生理特征，減少實驗的影響因素［6］。

流式細胞儀檢查細胞凋亡，對PC12 細胞凋亡進行分析。在甘木通乙酸乙酯提取物的作用下，細胞凋亡數(shù)明顯減少，表明甘木通乙酸乙酯提取物可以有效抑制缺氧引起的細胞凋亡。并且Hoechst 33258 染色結果進一步證明甘木通乙酸乙酯提取物對缺氧細胞的保護作用。

JC-1 在細胞中以單體和聚合體形式存在，在正常細胞，由于線粒體的極性，JC-1 被攝入進入線粒體形成多聚體，發(fā)出紅色熒光；而在凋亡的細胞中，細胞線粒體極性下降，JC-1 從線粒體釋放至胞質(zhì)，以單體形式存在，呈綠色熒光；通過不同熒光比值，檢測線粒體的相對膜電位。本實驗中，模型組中的線粒體膜電位明顯下降，而甘木通乙酸乙酯提取物可以明顯提高線粒體膜電位 （P＜0.05），提示甘木通乙酸乙酯提取物的保護作用可能與影響線粒體膜電位相關。

研究顯示Bcl-2 和caspase 蛋白家族均參與了腦缺血線粒體凋亡途徑［11］。2 種蛋白直接參與釋放細胞色素C （CytC） 的線粒體膜通透性轉換孔的調(diào)節(jié)。Bcl-2 蛋白家族分為促凋亡蛋白（Bax、Bad等） 和抑制凋亡蛋白（Bcl-2），2 種功能相反的蛋白主要通過影響線粒體的膜電位以及CytC 水平影響細胞凋亡進程，2 者表達高低直接反映細胞凋亡情況［12］。caspase 蛋白家族在腦缺血活化明顯［13］。細胞中Bcl-2 低表達，可引起線粒體相關的細胞核固縮和DNA 裂解以及Cyt C 從線粒體釋放，導致活化型caspase-3 （cleaved caspase-3） 出現(xiàn)，表明細胞處于凋亡狀態(tài)。蛋白印跡結果顯示，模型組Bax、cleaved caspase-3 表達增加，Bcl-2 表達明顯減少，說明細胞凋亡損傷明顯；甘木通乙酸乙酯提取物作用 后，Bcl-2 表達增 加，Bax、cleaved caspase-3 表達逐漸減少，說明甘木通乙酸乙酯提取物可以抑制缺氧誘導的細胞凋亡，并且其作用可能與線粒體凋亡途徑相關。

細胞凋亡開始時，細胞內(nèi)的谷胱甘肽水平下降以及活性氧（ROS） 的升高，可引起煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的還原態(tài)NADH 和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸水平下降，并引起胞內(nèi)O2-聚集，影響線粒體膜電位，最終導致細胞凋亡［14］。MDA 是O2-引起的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，其可以反映O2-對細胞的損失；而SOD 可有效清除細胞內(nèi)O2-，保護細胞。本研究結果顯示甘木通乙酸乙酯提取物可有效降低缺氧誘導PC12 細胞MDA 水平，提高SOD 水平，表明甘木通乙酸乙酯提取物能有效減少PC12 細胞氧化損傷，起到保護細胞的作用。

綜上所述，甘木通乙酸乙酯提取物具有神經(jīng)保護作用并且其作用方式可能是通過提高細胞內(nèi)SOD 水平，減少氧自由基對細胞的損害，影響線粒體凋亡途徑，從而抑制缺氧誘導的細胞凋亡，保護細胞。研究表明，甘木通主要藥效成分為多種黃酮苷［15］，其神經(jīng)保護作用可能與甘木通提取物中的黃酮苷密切相關，本課題進一步的研究將基于此，尋找突破口，全面深入探討甘木通對缺血性中風的作用以及作用機制研究。