李志強(qiáng)周紅秋歐陽 臻戴 軍 魏 淵韓邦興?

（1.江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江212013； 2.安徽省中藥資源保護(hù)與持續(xù)利用工程實(shí)驗(yàn)室，安徽 六安237012； 3.皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，安徽 六安237012）

霍山石斛Dendrobium huoshanenseC.Z.Tang et S.J.Cheng 為蘭科石斛屬多年生草本植物，在我國有著悠久的藥用歷史?；羯绞晕⒑?，味甘、淡，在《本草綱目拾遺》 中有“清胃除虛熱，生津已勞損” 的記載［1］?，F(xiàn)代藥理研究［2-4］發(fā)現(xiàn)霍山石斛具有保肝、抗氧化、抗衰老、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤和抗白內(nèi)障等功效。因其廣泛的藥理活性，霍山石斛享有“中華仙草之最” 的美譽(yù)［5］。

野生霍山石斛多與苔蘚等附生在一起，生長在半陰性、濕潤的峭壁和石縫間，依靠須根從空氣中吸收水分，濕度對其光合作用影響較大，強(qiáng)光不利于其生長［6］?；羯绞植紖^(qū)域窄、自然繁殖率低，對生長環(huán)境要求十分苛刻，加之人們過度采挖，野生霍山石斛資源瀕臨滅絕［7］?；羯绞N子在自然環(huán)境下萌發(fā)率極低，而組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)可以通過類原球莖等途徑獲取成活率高的霍山石斛種苗［8］?；羯绞N苗的培育模式主要為仿野生種植、林下石子種植以及設(shè)施種植模式。仿野生種植模式完全模擬野生霍山石斛的生長環(huán)境，選取具有適宜溫濕度及光照等條件的山崖，將種苗栽植于山崖石縫中使其自然生長。林下石子種植模式則選擇山坡中通風(fēng)較好、疏密適中的闊葉林、針葉林或針闊混交林，根據(jù)山體地形整理成梯田形狀，采用石子和苔蘚等作為基質(zhì)［9］。設(shè)施種植是在大棚中控制溫度濕度、通風(fēng)和光照，以松樹皮等作為基質(zhì)進(jìn)行種植［10］?；羯绞姆乱吧土窒率臃N植都采用了生態(tài)種植模式，即通過模擬野生霍山石斛的自然生長環(huán)境，以期霍山石斛品質(zhì)和療效接近或達(dá)到野生霍山石斛水平。生態(tài)種植注重生態(tài)系統(tǒng)的整體性，提高栽培藥材質(zhì)量，促進(jìn)中藥資源的可持續(xù)發(fā)展［11］。不同種植模式的藥材所受光照、溫度等環(huán)境條件不同，影響了次生代謝產(chǎn)物的積累量，導(dǎo)致其臨床療效產(chǎn)生差異［12］。隨著霍山石斛市場需求量的增加，人們對霍山石斛品質(zhì)的要求不斷提高，而不同模式種植的霍山石斛是否存在藥效差異，何種種植模式下的霍山石斛具有最佳藥效以及產(chǎn)生差異的相關(guān)物質(zhì)基礎(chǔ)，目前尚未見報道，生態(tài)種植模式的霍山石斛藥效是否優(yōu)于設(shè)施種植仍待驗(yàn)證。課題組前期研究［13］發(fā)現(xiàn)，霍山石斛對四氯化碳致小鼠急性肝損傷具有顯著的保護(hù)作用。本研究使用小鼠不同急性肝損傷模型評價生態(tài)種植模式的仿野生種植、林下石子種植和設(shè)施種植模式的霍山石斛對肝損傷的保護(hù)作用，為優(yōu)質(zhì)霍山石斛生態(tài)種植模式規(guī)范化及其推廣提供理論依據(jù)，以期為霍山石斛臨床應(yīng)用及資源可持續(xù)發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動物 SPF 級C57BL／6 小鼠，雄性，8 周齡，體質(zhì)量（20±2） g，購自江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，動物生產(chǎn)許可證號SCXK （蘇） 2018-0053，實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后用于正式實(shí)驗(yàn)，維持12 h 明暗交替照明，自由飲水、進(jìn)食。

1.2 藥物 仿野生種植、林下石子種植和設(shè)施種植霍山石斛Dendrobium huoshanenseC.Z.Tang et S.J.Cheng 鮮品均由皖西學(xué)院韓邦興教授提供和鑒定。石斛榨汁液的制備參考課題組前期文獻(xiàn)［12］，將新鮮的石斛去根洗凈，剪段，稱取10 g，置于榨汁機(jī)中，加入100 mL 蒸餾水榨汁，用200 目濾布過濾，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑 對乙酰 氨基酚 （APAP，批 號FD170246）、環(huán)磷酰胺（CTX，批號DA110067） 購自薩恩化學(xué)技術(shù) （上海） 有限公司；四氯化碳（CCl4，批號20170803） 購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT，批號20180610）、谷草轉(zhuǎn)氨酶 （AST，批 號 20180607）、丙二醛（MDA，批號20180608）、超氧化物歧化酶（SOD，批號20180607） 試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.4 儀器 Spectra Max 190 型酶標(biāo)儀（美國MD公司）；SK-Ⅰ快速混勻器 （江蘇中大儀器廠）；IKA T10 basic-S25 組織勻漿器（德國IKA 公司）；Pic017 臺式離心機(jī) （美國Thermo Fisher 公司）；Model 754 型紫外分光光度計（上?，F(xiàn)科儀器有限公司）；TE601-L 電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。

2 方法

2.1 造模、分組與給藥

2.1.1 CCl4肝損傷模型 將C57BL／6 小鼠隨機(jī)分為8 組，每組10 只，分別為空白對照組、模型組、霍山石斛仿野生種植低劑量組［生藥1.25 g／kg，參照《中國藥典》 石斛用量］、霍山石斛仿野生種植高劑量組（生藥7.5 g／kg）、霍山石斛林下石子種植低劑量組（生藥1.25 g／kg）、霍山石斛林下石子種植高劑量組（生藥7.5 g／kg）、霍山石斛設(shè)施種植低劑量組（生藥1.25 g／kg） 和霍山石斛設(shè)施種植高劑量組（生藥7.5 g／kg）。各給藥組連續(xù)灌胃給藥14 d，1 次／d，正常組和模型組同時給予等量的生理鹽水，末次給藥2 h 后，模型組和霍山石斛給藥組腹腔注射0.5% CCl4橄欖油溶液（10 mL／kg） 進(jìn)行肝損傷造模［13］，空白對照組注射等量的橄欖油，禁食不禁水，12 h 后眼底靜脈竇采血，并取出肝臟。

2.1.2 APAP 肝損傷模型 分組同“2.1.1” 項(xiàng)下分組，各給藥組連續(xù)灌胃給藥14 d，1 次／d，末次給藥2 h 后，模型組和各給藥組腹腔注射APAP（500 mg／kg） 進(jìn)行肝損傷造模［14］，空白對照組注射等量生理鹽水，禁食不禁水，12 h 后眼底靜脈竇采血，并取出肝臟。

2.1.3 CTX 肝損傷模型 分組同“2.1.1” 項(xiàng)下分組，各給藥組連續(xù)灌胃給藥14 d，1 次／d，空白對照組注射等量生理鹽水，第6 天開始，模型組和各給藥組每天腹腔注射CTX （80 mg／kg） 進(jìn)行肝損傷造模［15］。末次給藥后，禁食不禁水，12 h 后眼底靜脈竇采血，并取出肝臟。

2.2 血清指標(biāo)及肝組織中相關(guān)酶的測定 小鼠血樣于37 ℃靜置30 min，3 800 r／min 離心10 min，取血清，按照試劑盒的說明分別測定小鼠血清中ALT 和AST 水平。稱取肝臟相同部位的肝組織制成10%肝勻漿，3 800 r／min 離心10 min，取上清，按試劑盒說明檢測SOD 及MDA 水平。

2.3 肝臟病理組織切片觀察 取小鼠肝臟相同部位組織，置于10% 甲醛中浸泡固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE 染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟組織病理學(xué)變化。

2.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用GraphPad Prism 6.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以（） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P≤0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 CCl4肝損傷模型

3.1.1 不同種植模式霍山石斛對CCl4肝損傷小鼠血清中ALT、AST 水平和肝組織勻漿中SOD、MDA水平的影響 與空白對照組比較，模型組小鼠血清ALT、AST 水平升高（P＜0.01）；肝組織中SOD 水平降低，MDA 水平升高（P＜0.01）。與模型組比較，仿野生種植高劑量組和林下石子種植高劑量組ALT、AST 水平降低（P＜0.05），其中ALT 分別降低了46.10%、53.59%，AST 分別降低了24.90%、29.47%；而設(shè)施種植高劑量組ALT 和AST 分別降低了 12.30%、11.85%，差異無 統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與模型組比較，各給藥組均能提高SOD 水平（P＜0.01），抑制MDA 水平（P＜0.05，P＜0.01）。見圖1。

3.1.2 不同種植模式霍山石斛對CCl4肝損傷小鼠肝臟病理變化的影響 空白對照組小鼠肝細(xì)胞排列正常呈條索狀，以小葉中央靜脈為中心向四周呈放射狀排列，無炎細(xì)胞浸潤；模型組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞核固縮濃染，肝細(xì)胞炎癥浸潤；各種植模式霍山石斛給藥組肝組織與模型組相比病理變化減輕，肝小葉內(nèi)肝板排列較整齊，見圖2。

3.2 APAP 肝損傷模型

圖1 不同種植模式霍山石斛對CCl4 致肝損傷小鼠血清中ALT、AST 和肝組織勻漿中SOD、MDA 水平的影響（n＝10）Fig.1 Effects of differently cultivated DH on the serum ALT and AST levels，and hepatic SOD，MDA of mice with CCl4-induced liver injury （n＝10）

圖2 CCl4 致肝損傷小鼠肝臟病理學(xué)變化（×200）Fig.2 Hepatic pathological changes of mice with CCl4-induced liver injury （×200）

3.2.1 不同種植模式霍山石斛對APAP 肝損傷小鼠血清中ALT、AST 水平和肝組織勻漿中SOD、MDA 水平的影響 與正常對照組比較，模型組小鼠血清中ALT、AST 水平升高，肝組織中SOD 水平降低，MDA 水平升高（P＜0.01）。與模型組比較，仿野生種植低高劑量組和林下石子種植低高劑量組ALT 分別降低了18.55%、37.00%、26.66%、29.54% （P＜0.05，P＜0.01），AST 分別降低了36.83%、43.82%、41.19%、32.61% （P＜0.01）；設(shè)施種植高劑量組AST 水平降低了33.63%（P＜0.01）。與模型組比較，林下石子種植低、高劑量組SOD 水平分別升高了21.23%、21.20%（P＜0.05），設(shè)施種植高劑量組SOD 水平升高了20.50% （P＜0.01）。與模型組比較，林下石子種植低高劑量組MDA 水平分別下降了62.22%、46.25% （P＜0.01），設(shè)施種植低高劑量組MDA 分別降低了1.51% （P＞0.05）、62.22% （P＜0.01）。見圖3。

圖3 不同種植模式霍山石斛對APAP 致肝損傷小鼠血清中ALT、AST 和肝組織勻漿中SOD、MDA 水平的影響（n＝10）Fig.3 Effects of differenly cultivated DH on serum ALT and AST levels and hepatic SOD，MDA in mice with APAP-induced liver injury （n＝10）

3.2.2 不同種植模式霍山石斛對APAP 肝損傷小鼠肝臟病理變化的影響 空白對照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)未發(fā)生病理改變，細(xì)胞核明顯，無炎細(xì)胞浸潤；模型組小鼠肝小葉有點(diǎn)狀壞死，肝細(xì)胞腫脹，炎性細(xì)胞浸潤；不同種植模式霍山石斛給藥組肝組織與模型組相比有改善，肝細(xì)胞腫脹，但肝細(xì)胞排列較正常，炎性細(xì)胞浸潤減少，見圖4。

3.3 CTX 肝損傷模型

3.3.1 不同種植模式霍山石斛對CTX 肝損傷小鼠血清中ALT、AST 水平和肝組織勻漿中SOD、MDA水平的影 與正常對照組比較，模型組小鼠血清中ALT、AST 水平升高（P＜0.01），肝組織中SOD 水平降低（P＜0.01），MDA 水平升高（P＜0.01）。與模型組比較，仿野生種植高劑量組和林下石子種植高劑量組ALT 分別降低了23.79%、9.07%，AST 分別降低了34.43%、25.35%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01），設(shè)施種植高劑量組ALT 和AST 分別降低了7.44% （P＜0.05）、8.69%（P＞0.05）。與模型組比較，生態(tài)種植模式的仿野生低高劑量組和林下石子種植低、高劑量組SOD水平升高了18.33%、12.81%、13.04%、11.75%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，仿野生種植高劑量組MDA 水平下降了38.61%（P＜0.01）。見圖5。

3.3.2 不同種植模式霍山石斛對CTX 肝損傷小鼠肝臟病理變化的影響 空白對照組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝小葉清晰可辨，肝細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞核體積較大位于細(xì)胞中央；模型組小鼠肝組織出現(xiàn)明顯的病理變化，肝細(xì)胞排列紊亂，炎性浸潤嚴(yán)重；與模型組比較，不同種植模式霍山石斛給藥組小鼠肝細(xì)胞腫脹和胞質(zhì)疏松程度減輕，小葉結(jié)構(gòu)較清晰，細(xì)胞排列較整齊，點(diǎn)狀壞死減少。見圖6。

圖4 APAP 致肝損傷小鼠肝臟病理學(xué)變化（×200）Fig.4 Hepatic pathological changes of mice with APAP-induced liver injury （×200）

圖5 不同種植模式霍山石斛對CTX 致肝損傷小鼠血清中ALT、AST 和肝組織勻漿中SOD、MDA 水平的影響（n＝10）Fig.5 Effects of differently cultivated DH on serum ALT and AST levels，and hepatic SOD，MDA in mice with CTX-induced liver injury （n＝10）

4 討論

圖6 CTX 致肝損傷小鼠肝臟病理學(xué)變化（×200）Fig.6 Hepatic pathological changes of mice with CTX-induced liver injury （×200）

隨著大健康產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，霍山石斛因其廣泛的藥理活性，市場需求量劇增。目前霍山石斛存在著多種種植模式，不同種植模式對藥材品質(zhì)的影響一直是醫(yī)藥科研工作者關(guān)注的重點(diǎn)。甘金佳等［16］研究了不同栽培方式金線蓮的品質(zhì)，由于栽培基質(zhì)的松密度透氣性和微生物含有量的不同，使得金線蓮根數(shù)和根長度差異較大，且林下栽培方式更有利于有效成分黃酮和多糖含有量的積累。周鵬等［17］研究了不同種植方式黃芪4 種黃酮類成分和總黃酮的含有量，發(fā)現(xiàn)野生品種黃芪中毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷和總黃酮的含有量高于栽培品種。中藥生態(tài)種植根據(jù)藥用植物生理和生態(tài)特性，在遵循自然規(guī)律的基礎(chǔ)上優(yōu)化種植環(huán)境，改善藥用植物的生理狀況，可使藥材品質(zhì)和療效達(dá)到最佳［18］?；羯绞闹饕N植模式有采用生態(tài)種植的仿野生種植模式和林下石子種植模式，以及在大棚中種植的設(shè)施種植模式，關(guān)于這幾種種植模式的霍山石斛的藥效差異至今尚未有比較，本研究采用體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)的方法，首次比較了不同種植模式的霍山石斛對小鼠肝損傷保護(hù)的作用。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)對肝損傷的保護(hù)作用是霍山石斛多種藥理活性之一［13］，而肝損傷藥效研究具有較好的量化指標(biāo)，如肝酶學(xué)的改變、物質(zhì)合成及生物降解功能的變化等［19］。Hu 等［20］研究人參皂苷Rk1 對APAP 致小鼠肝損傷的保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rk1 給藥組ALT、AST、MDA 水平顯著降低，同時肝臟抗氧化劑SOD 和GSH 水平均升高，表明人參皂苷Rk1 對APAP 誘導(dǎo)的肝毒性具有保護(hù)作用。陳春等［21］研究酢漿草對CCl4致急性肝損傷大鼠的保護(hù)作用，通過檢測大鼠血清中ALT、AST、T-SOD、MDA 等發(fā)現(xiàn)酢漿草對CCl4致急性肝損傷大鼠具有保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)采用多種肝損傷模型小鼠進(jìn)行了多種肝損傷量化指標(biāo)的測定，結(jié)果均顯示生態(tài)種植的霍山石斛保肝藥效優(yōu)于設(shè)施種植。

在不同種植模式霍山石斛對CCl4致肝損傷的保護(hù)作用研究中，模型組與空白對照組比較，ALT、AST 和MDA 水平顯著升高，SOD 水平顯著下降，并且肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，肝細(xì)胞壞死和變性，說明模型復(fù)制成功，各給藥組均能不同程度改善血清指標(biāo)，同時減輕肝細(xì)胞變性和壞死程度，說明不同種植模式霍山石斛均對CCl4致肝損傷有一定保護(hù)作用。但是生態(tài)種植模式霍山石斛降低ALT和AST 水平的效果優(yōu)于設(shè)施種植模式，綜合評價不同模式霍山石斛降低ALT、AST、MDA 水平，升高SOD 水平的效果，生態(tài)種植模式的霍山石斛對CCl4致肝損傷的保護(hù)作用最佳。本研究使用了藥物性肝損傷CTX 模型以進(jìn)一步研究不同種植模式霍山石斛對肝損傷的保護(hù)作用。在此模型中，生態(tài)模式的仿野生和林下石子種植組SOD 升高，設(shè)施種植組升高SOD 無顯著性差異。綜合評價其他生化指標(biāo)，生態(tài)模式種植的霍山石斛保肝效果最佳。在APAP 肝損傷模型中，仿野生種植和林下石子種植霍山石斛保肝效果顯著，設(shè)施種植霍山石斛效果也較好。綜合各組霍山石斛保肝效果，生態(tài)種植模式霍山石斛效果最佳。

生態(tài)種植與設(shè)施種植的霍山石斛對不同肝損傷小鼠的保護(hù)效果的差異，不僅與不同肝損傷機(jī)制有關(guān)，而且與不同環(huán)境下霍山石斛的次生代謝產(chǎn)物積累量有關(guān)?；羯绞瘜W(xué)成分包括多糖、生物堿、黃酮、酚類、氨基酸和微量元素等［22］。其中，霍山石斛多糖能保護(hù)小鼠亞急性酒精性肝損傷，其保肝活性與清除自由基，抑制脂質(zhì)過氧化，下調(diào)肝組織CYP2E1、TNF-α 和IL-1β 表達(dá)相關(guān)［23］。石斛類藥材所含生物堿主要為石斛堿，金釵石斛中的生物堿對CCl4所致急性肝損傷有顯著改善作用，與其抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)［24］。石斛酚在抗白內(nèi)障、抑制醛糖還原酶，柚皮素在抗氧化、抗炎等方面具有活性［25-27］。盡管霍山石斛不同種植模式產(chǎn)生的藥效差異物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確，本研究證實(shí)了生態(tài)種植霍山石斛保肝藥效的更優(yōu)品質(zhì)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)研究的生態(tài)種植模式與設(shè)施種植模式霍山石斛對小鼠肝損傷的保護(hù)作用存在差異，生態(tài)種植模式的霍山石斛保肝效果優(yōu)于設(shè)施種植。造成藥效差異的原因可能與不同種植模式的栽培基質(zhì)、環(huán)境等相關(guān)，從而引起霍山石斛的性狀、有效成分種類及含有量的差異，相關(guān)物質(zhì)基礎(chǔ)及具體作用機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。