楊志敏，蒙艷麗，王慧慧，王曉溪，王偉明

（黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150036）

肺炎支原體 （Mycoplasma pneumoniae，MP）是一種原核微生物，其細(xì)胞體積介于細(xì)菌與病毒之間，侵入機(jī)體后可粘附在宿主細(xì)胞表面，破壞細(xì)胞膜，引起肺泡損傷，從而損害肺功能。肺炎支原體肺炎 （Mycoplasma pneumoniaepneumonia，MPP）是由肺炎支原體引起的急性呼吸道感染性疾病，近年來(lái)難治性肺炎支原體肺炎病例數(shù)量明顯呈現(xiàn)上升趨勢(shì)［1-2］。

目前臨床治療肺炎支原體感染以大環(huán)內(nèi)酯類抗生素為主，但大環(huán)內(nèi)酯類藥物常引起較重的胃腸道反應(yīng)，其耐藥菌株近年來(lái)也有上升趨勢(shì)［3-4］。中藥治療支原體肺炎具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，由于其作用靶點(diǎn)眾多，表現(xiàn)出既能抑制肺炎支原體又可以保護(hù)肺上皮細(xì)胞，從而促進(jìn)肺部損傷的修復(fù)，在臨床上取得了良好的治療效果。

芩百清肺濃縮丸（芩百） 是用于臨床治療小兒支原體肺炎的中藥制劑，由黃芩、百部、地龍等6 味中藥組成，具有清熱解毒、潤(rùn)肺止咳的功效。前期實(shí)驗(yàn)［5-6］表明其對(duì)肺炎支原體、肺炎雙球菌等具有良好的抑制作用，能促進(jìn)氣道組織修復(fù)和提高免疫功能。

RAS／RAF／MEK／ERK 信號(hào)級(jí)聯(lián)通路又稱ERK通路，是將細(xì)胞表面受體信息傳遞到細(xì)胞內(nèi)的主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一，其中MEK 是級(jí)聯(lián)通路特異性決定因子的中心信號(hào)蛋白［7-9］。ERK 通路通過(guò)激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)后，磷酸化激活的ERK1／2 由胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到核內(nèi)，進(jìn)而介導(dǎo)c-jun 等的轉(zhuǎn)錄活化，參與細(xì)胞增殖與分化、細(xì)胞骨架的構(gòu)建等多種生物學(xué)反應(yīng)［10］。

本研究利用支原體感染A549 細(xì)胞和BALB／c小鼠探究給藥前后對(duì)細(xì)胞增殖與凋亡的影響，以及對(duì)小鼠各組實(shí)驗(yàn)樣本MEK、c-jun 表達(dá)的影響，初步探討芩百清肺濃縮丸促進(jìn)肺上皮細(xì)胞增殖而產(chǎn)生修復(fù)作用的機(jī)制。

1 材料

1.1 藥物與試劑 芩百清肺濃縮丸，棕色薄膜包衣濃縮水丸，由黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院制劑室生產(chǎn)，符合2015 年版《中國(guó)藥典》 丸劑下的各項(xiàng)規(guī)定；阿奇霉素分散片（批號(hào)274150404） 購(gòu)自石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司。PPLO （批號(hào)7110677）購(gòu)自美 國(guó) BD 公 司；RPMI-1640 （貨 號(hào)SH30809.01）、胎牛血清（貨號(hào)SH30070.03） 購(gòu)自美國(guó)Hyclone 公司；RNA 提取試劑盒 （貨號(hào)DP419） 購(gòu)自中國(guó)天根生化科技（北京） 有限公司；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)G004-1） 購(gòu)自南京建成生物工程研究所；Real-Time PCR 試劑盒（貨號(hào)A6020） 購(gòu)自美國(guó)Promega 公司；Mouse anti-MEK antibody （貨號(hào)ab131517）、Mouse anti-c-jun antibody （貨號(hào)ab32137） 均購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司；Goat anti-mouse antibody （貨號(hào)ZB-2305） 購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；MTT （貨號(hào)M2128）、DMSO （貨號(hào)D2650） 購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；引物均合成自上海生物工程技術(shù)有限公司。

1.2 儀器 M200 多功能酶標(biāo)儀（奧地利Tecan 公司）；FACSCalibur 流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD 公司）；Line Gene 9600 Real-Time PCR 儀（杭州博日科技有限公司）；熒光顯微鏡DP72 （日本Olympus公司）。

1.3 肺炎支原體 肺炎支原體 （批號(hào)ATCC15531） 購(gòu)自美國(guó)Type Culture Collection 公司，培養(yǎng)于含20% 胎牛血清，10% 酵母的2.1%PPLO 培養(yǎng)基中，每隔7 d 傳代1 次。

1.4 細(xì)胞株 A549 細(xì)胞購(gòu)自上海中科院細(xì)胞中心，細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素溶液的RPMI 1640 完全培養(yǎng)基中，置于含5%CO2、37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱，隔天換液。

1.5 動(dòng)物 SPF 級(jí)6 周齡BALB／c 小鼠共60 只，體質(zhì)量20～22 g，雌雄各半，購(gòu)于遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份 有限公 司，動(dòng)物合 格證號(hào)211002300025153。小鼠飼養(yǎng)于室溫25 ℃和濕度60% GLP 實(shí)驗(yàn)室。

2 方法

2.1 芩百清肺濃縮丸對(duì)A549 細(xì)胞的影響

2.1.1 含藥血清制備 18 只大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、芩百清肺濃縮丸組，每組6 只，用藥劑量按成人臨床劑量18 g／d 換算為大鼠等劑量后的5 倍灌胃給藥，即8.1 g／kg?？瞻捉M、模型組大鼠灌胃給予等量蒸餾水，1 次／d，連續(xù)7 d。最后1次給藥3 h 后，大鼠腹主動(dòng)脈穿刺取血，離心，取上清，除菌，滅活，-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞活性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549 細(xì)胞，以細(xì)胞濃度1×104／mL （每孔100 μL）接種于96 孔板中，分為空白組、模型組、10%芩百含藥血清組、20%芩百含藥血清組。除空白組外，其余組使用1×105CCU 肺炎支原體感染A549 細(xì)胞4 h，使用培養(yǎng)液洗去不黏附的肺炎支原體。芩百含藥血清組給予相應(yīng)的含藥血清培養(yǎng)基200 μL，空白組與模型組給予等量空白組血清培養(yǎng)基，每組設(shè)3個(gè)復(fù) 孔。3 d 后，每孔加 入50 μL MTT 溶 液（5 mg／mL），培養(yǎng)4 h 后吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔再加入200 μL DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，酶標(biāo)儀測(cè)量490 nm 處各孔的吸光值（OD）。增殖率＝［（OD實(shí)驗(yàn)組-OD模型組） ／OD模型組］ ×100%。

2.1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 使用Annexin V／PI 雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡，收集生長(zhǎng)狀態(tài)良好的A549 細(xì)胞，接種于6 孔板，每孔接種1.0×106個(gè)，置于5% CO2、37 ℃的恒溫箱中孵育24 h。按照“2.1.2” 項(xiàng)下進(jìn)行分組、感染，給藥48 h 后，用不含EDTA 的胰酶消化收集細(xì)胞，用PBS 洗滌細(xì)胞2 次，2 000 r／min 常溫下離心5 min，棄上清，加入500 μL 結(jié)合液懸浮細(xì)胞，加入5 μL Annexin V 混勻后，再加入5 μL PI 混勻，室溫避光孵育15 min，上機(jī)檢測(cè)。

2.2 芩百清肺濃縮丸對(duì)MP 感染小鼠的影響

2.2.1 分組、造模及給藥 小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、芩百清肺濃縮丸（低、中、高劑量） 組、阿奇霉素組，每組10 只。模型組和各給藥組小鼠滴鼻法感染20 μL 1×106CCU 肺炎支原體3 d，給藥組分別灌胃予藥芩百濃縮丸低劑量1.15 g／kg、中劑量2.3 g／kg、高劑量4.6 g／kg 及阿奇霉素32 mg／kg，1 次／d，給藥6 d?？瞻捉M和模型組給生理鹽水，給藥結(jié)束后處死小鼠取出肺組織，部分HE 染色和免疫組化，部分提取RNA。

2.2.2 HE 染色肺組織形態(tài)學(xué)觀察 小鼠肺組織取出后放在10%福爾馬林24 h，石蠟包埋，切片在二甲苯和不同濃度酒精中浸泡，蘇木素和伊紅染色，顯微鏡拍照觀察病變區(qū)及附近肺組織肺充血及肺出血、肺泡內(nèi)滲出、肺泡及血管壁的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡壁增厚程度、肺透明膜的形成等病理變化。

2.2.3 免疫組織化學(xué)法觀察MEK、c-jun 蛋白表達(dá) 肺組織石蠟切片65 ℃恒溫箱烘1 h，過(guò)二甲苯脫蠟、脫苯，PBS 洗滌3 次，3% H2O2去離子水孵育2 min。枸櫞酸緩沖液中煮沸進(jìn)行抗原修復(fù)，滴加一抗（MEK 1 ∶100，c-jun 1 ∶250），4 ℃過(guò)夜，PBS 洗 滌3 次。滴加反 應(yīng)增強(qiáng) 液，室溫孵 育20 min，PBS 洗滌3 次。滴加增強(qiáng)酶標(biāo)山羊抗兔IgG 聚合物，室溫孵育30 min，PBS 洗滌3 次。滴加DAB 溶液顯色，自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染，分化、沖洗反藍(lán)，脫水、透明、封片、閱片。

2.2.4 RT-PCR 實(shí)驗(yàn)檢 測(cè)MEK、c-junmRNA 表達(dá) 各組小鼠肺組織收集后加入TRIzol 試劑提取RNA，經(jīng)酶標(biāo)儀檢測(cè)濃度后，RNA 稀釋至100 ng／μL。實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系為1 μL 組織RNA，上下游引物各1 μL，17 μL 反應(yīng)液（反應(yīng)液根據(jù)PCR 試劑盒說(shuō)明書配制）。擴(kuò)增條件為95 ℃、10 min，95 ℃、10 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，40 個(gè)循環(huán)；溶解曲線分析95 ℃、10 s，臺(tái)階采樣，臺(tái)階溫度0.5 ℃。引物序列為MEK正向5'-CCTGCAACTGGAAGA AGGAA-3'，反向5'-AGACAGGAGGGTTGTGGATG-3'。c-jun正向5'-TCCACGGAGAAGAAGCTCAC-3'，反 向 5'-CCTCTGGGTCAGGAAAGTTG-3'。β-actin正 向5'-GACGGCCAGGTCATCACTATTG-3'，反向5'-AGGAAGGCTGGAAAA GAGCC-3'。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以（） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P≤0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 芩百清肺濃縮丸對(duì)A549 細(xì)胞增殖的影響 如圖1、表1 所示，隨著芩百含藥血清藥物濃度的升高，A549 細(xì)胞OD增大（P＜0.05），給藥組細(xì)胞增殖率分別為36.23%、58.37%。

圖1 各組OD （n＝3）Fig.1 OD in each group （n＝3）

表1 芩百清肺濃縮丸對(duì)A549 細(xì)胞增殖率的影響（n＝3）Tab.1 Effects of QQPs on the proliferation rate of A549 cells （n＝3）

3.2 芩百清肺濃縮丸對(duì)A549 細(xì)胞凋亡的影響如圖2～3 所示，與空白組相比，模型組細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05），芩百含藥血清組細(xì)胞凋亡率減少（P＜0.05）。

3.3 肺組織的病理改變 如圖4 所示，模型組出現(xiàn)肺泡塌陷，肺泡壁充血，支氣管上皮脫落，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；芩百組癥狀均有所改善，其中高、中劑量組與空白組的肺組織相似，低劑量組與阿奇霉素組相似，高劑量組僅有少量充血和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

3.4 免疫組織化學(xué)法觀察MEK、c-jun 蛋白表達(dá) 模型組細(xì)胞顏色著色淺且面積較小，蛋白表達(dá)較低，IHC＜3 為陰性?？瞻捉M與芩百高、中、低劑量組均著色深，阿奇霉素組著色淺。與模型組比較，芩百高、中劑量 組 MEK 蛋白表 達(dá)升高（P＜0.05），高劑量 組表達(dá) 高于低 劑量組（P＜0.05）；芩百高、中、低劑量組c-jun 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），高劑量組表達(dá)高于低劑量組（P＜0.05）。見(jiàn)圖5～8。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)A549 細(xì)胞凋亡Fig.2 Resultant apoptosis rate of A549 cells by flow cytometry

圖3 芩百清肺濃縮丸對(duì)A549 細(xì)胞凋亡的影響（n＝3）Fig.3 Effects of QQPs on apoptosis of A549 cells （n＝3）

圖4 肺組織病理檢測(cè)（HE，×20）Fig.4 Pathological examination of lung tissue （HE×20）

圖5 芩百對(duì)肺組織MEK 蛋白表達(dá)影響（×200）Fig.5 Effects of QQPs on expression of MEK protein in lung tissue （×200）

3.5 芩百清肺濃縮丸對(duì)小鼠MEK、c-junmRNA 表達(dá)影響 與模型組比較，芩百高、中、低劑量組及阿奇霉組MEKmRNA 表達(dá)升高（P＜0.05），其中芩百高劑量組較中、低劑量組表達(dá)升高（P＜0.05）；芩百高、低劑量 組c-junmRNA 表達(dá)升 高（P＜0.05）；芩百高劑量組與低劑量組c-jun表達(dá)較中劑量組升高（P＜0.05）。見(jiàn)圖9～10。

圖6 MEK 免疫組化評(píng)分（n＝10）Fig.6 Immunohistochemical scores of MEK （n＝10）

圖7 芩百對(duì)肺組織c-jun 蛋白表達(dá)影響（×200）Fig.7 Effects of QQPs on expression of c-jun protein in lung tissue （×200）

圖8 c-jun 免疫組化評(píng)分（n＝10）Fig.8 Immunohistochemical scores of c-jun （n＝10）

4 討論

圖9 芩百對(duì)肺組織MEK mRNA 表達(dá)影響（n＝10）Fig.9 Effects of QQPs on expression of MEK mRNA in lung tissue （n＝10）

圖10 芩百對(duì)肺組織c-jun mRNA 表達(dá)影響（n＝10）Fig.10 Effect of QQPs on expression of c-jun mRNA in lung tissue （n＝10）

肺炎支原體所引起的肺炎支原體肺炎占社區(qū)獲得性肺炎的40%，容易在兒童中引起暴發(fā)流行，給患者肺部造成嚴(yán)重?fù)p傷，可累及多個(gè)系統(tǒng)病變，甚至直接威脅患者的生命健康［11-13］。芩百清肺濃縮丸是治療支原體肺炎的優(yōu)勢(shì)中藥制劑，具有多年臨床研究基礎(chǔ)，然而在確切療效基礎(chǔ)上，其作用機(jī)制尚不明確。課題組前期實(shí)驗(yàn)研究［6］提示，芩百清肺濃縮丸給藥組能明顯改善肺炎支原體對(duì)大鼠肺組織結(jié)構(gòu)造成的異常損害，促進(jìn)上皮修復(fù)和纖毛再生。本研究揭示芩百清肺濃縮丸通過(guò)提高M(jìn)EK 與c-jun 的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)肺上皮細(xì)胞增殖而起到修復(fù)作用。

本實(shí)驗(yàn)首先通過(guò)MTT 法對(duì)體外培養(yǎng)的A549 細(xì)胞增殖進(jìn)行測(cè)定，顯示芩百清肺濃縮丸可在體外促進(jìn)肺炎支原體感染A549 細(xì)胞的增殖。進(jìn)一步通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了芩百清肺濃縮丸對(duì)A549 細(xì)胞凋亡的影響，也表明芩百能夠有效降低肺炎支原體感染A549 細(xì)胞的凋亡。體外實(shí)驗(yàn)揭示了芩百可能存在的促增殖效果，進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)更好的說(shuō)明芩百在治療肺炎支原體肺炎，修復(fù)肺損傷方面的作用。本研究目的是探討芩百對(duì)MEK 與c-jun 表達(dá)影響中潛在的促增殖修復(fù)機(jī)制，有研究顯示，通過(guò)激活Ras-Raf-MEK-ERK 信號(hào)通路，能夠使全腦I／R后小鼠的認(rèn)知功能障礙得到改善［14］；通過(guò)激活該通路，能夠誘導(dǎo)大鼠血管再生、加速創(chuàng)傷的愈合［15］。RAS／RAF／MEK／ERK 信號(hào)通路可以將細(xì)胞外信號(hào)，如生長(zhǎng)因子等傳遞入細(xì)胞核內(nèi)而磷酸化核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子c-jun，從而促進(jìn)細(xì)胞周期G1到S 期的進(jìn)展［16］。本研究運(yùn)用RT-PCR 和免疫組織化學(xué)法，闡明芩百清肺濃縮丸對(duì)MEK、c-junmRNA 與蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果顯示芩百清肺濃縮丸高中低劑量組均能上調(diào)MEK 與c-jun 表達(dá)。

綜合所述，芩百清肺濃縮丸可能通過(guò)激活RAS／RAF／MEK／ERK 信號(hào)通路，促進(jìn)小鼠受損肺上皮細(xì)胞的增殖與修復(fù)，從而改善肺炎支原體感染后的肺部損傷，發(fā)揮治療肺炎支原體肺炎的作用。