王風(fēng)云，李偉宏

（河南應(yīng)用技術(shù)職業(yè)學(xué)院，河南 鄭州450042）

莪術(shù)是姜科植物蓬莪術(shù)、溫郁金或廣西莪術(shù)的根莖［1］，莪術(shù)油是其主要提取物，具有較強(qiáng)的抗腫瘤、抗病毒、抗炎等作用［2-3］。莪術(shù)醇是莪術(shù)特征性成分，對乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、白血病、骨肉瘤等均具有抑制效果［4-6］，但藥效不高［7-8］。另外，莪術(shù)醇注射液中含有高濃度的增溶劑吐溫-80，臨床應(yīng)用時易引起溶血、過敏、疼痛等不良反應(yīng)［7］。

固體脂質(zhì)納米粒［9-14］是采用與人體生物相容性較好的脂質(zhì)材料制成的一種新型給藥系統(tǒng)，注射后可顯著增強(qiáng)藥物療效。本實(shí)驗(yàn)制備莪術(shù)醇固體脂質(zhì)納米粒，并對其粒徑、Zeta 電位、形態(tài)、體外釋藥、光降解等情況進(jìn)行考察，MTT 法評價其對人宮頸癌上皮細(xì)胞（Caski 細(xì)胞） 的抑制作用，以期為進(jìn)一步相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

Agilent 1100 型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；JY92-Ⅲ型超聲儀（浙江大天科學(xué)儀器有限公司）；QUINTX224-1CM 型電子天平 （德國Sartorius公司）；Zano-ZS90 型粒度分析儀（英國馬爾文儀器公司）；H-800 型透射電子顯微鏡（日本Hitachi 公司）；SZCL-H 型溫控磁力攪拌器（鄭州宇華儀器有限公司）；Kylin-Bell 型漩渦混合器（海門其林貝爾儀器制造有限公司）；FD10-QX 型真空凍干機(jī)（上海天賜科學(xué)儀器公司）；JXDC-400型氮?dú)獯祾邇x（拓赫機(jī)電科技上海有限公司）；HNA-122DTABA I 型CO2恒溫培養(yǎng)箱（日本三洋公司）；MR-96T 型酶標(biāo)儀（南京貝登醫(yī)療股份有限公司）。

莪術(shù)醇對照品 （批號100185-201507，純度99.9%，中國食品藥品檢定研究院）；莪術(shù)醇（批號Y-088-171005，純度98.8%，上海源葉生物科技有限公司）；單硬脂酸甘油酯（批號T160522，德國巴斯夫有限公司）；大豆卵磷脂（批號PC-98T，上海輔必成醫(yī)藥科技有限公司）；泊洛沙姆188（批號WPW1602B，德國巴斯夫公司）；胎牛血清（FBS）、RPMI-1640 培養(yǎng)基 （美國Gibco 公司）；胰蛋白酶（美國Hyclone 公司）；四甲基偶氮唑鹽（MTT，批號1524B37）、二甲基亞砜 （DMSO）（美國Amresco 公司）。

人宮頸癌上皮細(xì)胞（Caski 細(xì)胞，上海研域生物工程有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 莪術(shù)醇固體脂質(zhì)納米粒制備 采用乳化超聲分散法（避光操作）。稱取20 mg 莪術(shù)醇、80 mg大豆磷脂、300 mg 單硬脂酸甘油酯，溶于10 mL溫度為（60±1） ℃的無水乙醇中，作為有機(jī)相；另取0.2 g 泊洛沙姆188，溶于30 mL 溫度為（60±1） ℃的蒸餾水中，作為水 相。在轉(zhuǎn)速1 000 r／min條件下，將有機(jī)相逐滴加入水相中，繼續(xù)攪拌3 h，得到初乳（體積約15 mL），將其置于超聲波細(xì)胞粉碎儀中超聲處理8 min （功率600 W，每超聲3 s 間隔2 s） 后立即放到-20 ℃冰箱中固化，蒸餾水定容至30 mL，即得。

2.2 莪術(shù)醇含有量測定

2.2.1 色譜條件 Hypersil ODS-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈-水（40 ∶60）；體積流量1.0 mL／min；柱溫35 ℃；檢測波長215 nm；進(jìn)樣量20 μL。

2.2.2 線性關(guān)系考察 稱取10.20 mg 莪術(shù)醇對照品于100 mL 量瓶中（避光操作），加入70 mL 甲醇超聲溶解，靜置30 min 后甲醇定容至刻度，得到102 μg／mL 貯備液，放到冰箱中保存，流動相逐步稀釋成 5.1、10.2、25.5、51.0、102.0 μg／mL，在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo) （Y） 進(jìn)行回歸，得方程為Y＝1.414 6X-0.063 8 （r＝0.999 5），在5.1～102.0 μg／mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.3 供試品、空白溶液制備 精密稱取莪術(shù)醇固體脂質(zhì)納米?；鞈乙?.5 mL 于10 mL 量瓶中（避光操作），加入5 mL 乙腈超聲提取3 min，靜 置 30 min 后甲醇 定容至刻度，15 000 r／min離心15 min，取上清液，即得。同法制備空白溶液。

2.2.4 方法學(xué)考察分別取 102.0、51.0、5.1 μg／mL “2.2.2” 項(xiàng)下對照品溶液作為高、中、低質(zhì)量濃度，在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6 次，測得莪術(shù)醇峰面積RSD 分別為0.18%、0.13%、0.43%，表明儀 器精密 度良好。取“2.2.3” 項(xiàng)下供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h，在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得莪術(shù)醇峰面積RSD 為0.84%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。按“2.2.3” 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得莪術(shù)醇峰面積RSD 為1.46%，表明該方法重復(fù)性良好。取6.5 mL 102.0 μg／mL對照品溶液于10 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度（66.3 μg／mL），取0.8、1.0、1.2 mL于0.5 mL 空白固體脂質(zhì)納米?；鞈乙褐?，各平行3 份，按“2.2.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得莪術(shù)醇平均加樣回收率分別為99.01%、100.23%、99.87%，RSD 分別為1.14%、0.69%、1.38%。以上實(shí)驗(yàn)均避光操作。

2.3 包封率、載藥量測定 采用超濾離心法。量取2.0 mL 莪術(shù)醇固體脂質(zhì)納米?；鞈乙河诔瑸V離心管 中 （截留分子量 8 000～12 000 Da），15 000 r／min 離心60 min，取濾液，在 “2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計算莪術(shù)醇含有量（m游離）；量取0.5 mL 納米?；鞈乙河?0 mL 量瓶中，加入5 mL 乙腈超聲3 min，靜置30 min 后甲醇定容，15 000 r／min 離心15 min，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計算莪術(shù)醇含有量（m總），再測定包封率、載藥量，公式分別為包封率＝ ［（m總-m游離） ／m總］ × 100%，載藥量＝［（m總-m游離） ／m總質(zhì)］ ×100%，其中m總質(zhì)表示莪術(shù)醇固體脂質(zhì)納米?？傎|(zhì)量，平行3 次，取平均值。結(jié)果，平均包封率為83.27%，載藥量為3.83%。

2.4 粒徑分布、Zeta 電位測定 平行制備3 批莪術(shù)醇固體脂質(zhì)納米?；鞈乙?，取0.2 mL 與4.0 mL蒸餾水混勻，取3.5 mL 進(jìn)行測定，結(jié)果見圖1～2。由此可知，平均粒徑為（198.84±4.17） nm，PDI為0.151±0.013，Zeta 電位為（-21.8±2.5） mV。

圖1 莪術(shù)醇固體脂質(zhì)納米粒粒徑分布Fig.1 Particle size distribution of curcumolloaded solid lipid nanoparticles

圖2 莪術(shù)醇固體脂質(zhì)納米粒Zeta 電位Fig.2 Zeta potential of curcumol-loaded solid lipid nanoparticles

2.5 形態(tài)觀察 取100 μL 莪術(shù)醇固體脂質(zhì)納米粒，加入900 μL 蒸餾水，滴加到有支持膜的銅網(wǎng)上，均勻鋪展后靜置15 min，濾紙吸干，放到5%磷鎢酸溶液中浸泡8 min 染色，自然晾干，在透射電鏡（TEM） 下觀察形態(tài)，選定區(qū)域后拍攝電鏡照片，結(jié)果見圖3。由此可知，所制備的莪術(shù)醇固體脂質(zhì)納米粒呈類球形或球形，大小均勻，未見粘連現(xiàn)象。

圖3 莪術(shù)醇固體脂質(zhì)納米粒TEM 圖Fig.3 TEM image for curcumol-loaded solid lipid nanoparticles

2.6 體外釋藥研究

2.6.1 線性關(guān)系考察 取“2.2.2” 項(xiàng)下對照品貯備液，精密量取2.0 mL 于10 mL 量瓶中，流動相定容至刻度（20.4 μg／mL），流動相逐步稀釋成10.2、5.1、0.51、0.051 μg／mL 的對照品溶液，在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸，得方程為Y＝1.607 5X-0.078 1 （r＝0.999 7），在0.051～20.4 μg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6.2 方法學(xué)考察 分別取“2.6.1” 項(xiàng)下20.4、5.1、0.051 μg／mL 對照品溶液作為高、中、低質(zhì)量濃度，在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6次，測得莪術(shù)醇峰面積RSD 分別為0.62%、1.15%、1.38%，表明儀器精密度良好。取5 mL莪術(shù)醇固體脂質(zhì)納米?；鞈乙海?.64 mg／mL），置于活化的透析袋中 （截留分子量 8 000～14 000 Da），兩端扎緊，溶出介質(zhì)無250 mL 脫氣蒸餾水，設(shè)置溶出儀溫度為（37±1）℃，轉(zhuǎn)速為100 r／min，6 h 時取樣2 mL，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液，分別于0、2、8、12、24、36 h，在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得莪術(shù)醇峰面積RSD 為1.63%，表明溶液在36 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。取0.8、1.0、1.2 mL 5.1 μg／mL 對照品溶液，加到1.0 mL 供試品溶液中，各平行3 份，濾過，在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得平均加樣回收率分別為 99.12%、100.86%、99.05%，RSD 分別為1.71%、1.09%、1.53%。

2.6.3 體外溶出實(shí)驗(yàn) 取5 mL 莪術(shù)醇固體脂質(zhì)納米?；鞈乙海?.64 mg／mL） 和3.2 mg 莪術(shù)醇原料藥（加入5 mL 乙醇），置于活化的透析袋中（截留分子量8 000～14 000 Da），兩端扎緊（避光操作），溶出介質(zhì)為250 mL 脫氣蒸餾水，設(shè)置溶出儀溫度為（37±1）℃，轉(zhuǎn)速為100 r／min，于0、0.5、0.75、1、1.5、2、4、6、8、12、24、36 h各取樣2 mL，并立即補(bǔ)加2 mL 脫氣蒸餾水，在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計算累積釋放度，繪制釋藥曲線，結(jié)果見圖4，可知莪術(shù)醇在4 h內(nèi)幾乎全部溶出，而其固體脂質(zhì)納米粒在體外具有明顯緩釋特征，36 h 內(nèi)累積溶出度為61.81%；體外釋藥擬合結(jié)果見表1，可知它更符合Weibull 模型（R2＝0.960 5）。

圖4 莪術(shù)醇、莪術(shù)醇固體脂質(zhì)納米粒體外釋藥曲線Fig.4 In vitro drug release curves for curcumol and curcumol-loaded solid lipid nanoparticles

表1 體外釋藥擬合結(jié)果Tab.1 Results of in vitro drug release fitting

2.7 光穩(wěn)定性評價 分別配制6 份50 mL 莪術(shù)醇溶液及其固體脂質(zhì)納米?；鞈乙?，置于透明錐形瓶中，質(zhì)量濃 度均為 0.2 mg／mL 于日光 燈（4 500 lx，25 ℃） 下照射，于0、2、4、8、12、24 h 各精密取樣1 mL，置于5 mL 量瓶中，甲醇定容，在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見表2，可知固體脂質(zhì)納米粒可顯著提高莪術(shù)醇光穩(wěn)定性。

表2 莪術(shù)醇光穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of light stability tests for curcumol

2.8 抗腫瘤活性研究

2.8.1 給藥液制備 10.0 mg 莪術(shù)醇用50 mL DMSO 溶解，得到200 μg／mL 母液，臨用前用含10% FBS 的RPMI-1640 培養(yǎng)液 稀釋成25、50、100、150 μg／mL；取適量莪術(shù)醇固體脂質(zhì)納米?；鞈乙海ㄝg(shù)醇含有量為0.64 mg／mL），臨用前用含10% FBS 的RPMI-1640 培養(yǎng)液稀釋成25、50、100、150 μg／mL，即得。

2.8.2 細(xì)胞培養(yǎng) Caski 細(xì)胞于RPMI1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)（含10% 胎牛血清、100 μg／mL 鏈霉素、100 U／mL 青霉素），并置于溫度37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中。

2.8.3 實(shí)驗(yàn)方法 取對數(shù)生長期的Caski 細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化后輕輕吹打成單細(xì)胞懸液，用含10% FBS 的RPMI1640 培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至5×104／mL，接種于96 孔板中，每孔100 μL，置于溫度37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)液。設(shè)置空白溶劑組（培養(yǎng)液）、溶劑對照組（培養(yǎng)液+細(xì)胞）、莪術(shù)醇組、莪術(shù)醇固體脂質(zhì)納米粒組，每個質(zhì)量濃度設(shè)置3 個復(fù)孔，培養(yǎng)24、48、72 h 后取出96 孔板，每孔加入20 μL 5 mg／mL MTT 溶液，于37 下℃繼續(xù)孵育4 h，甩板后棄去殘留液體，每孔加入150 μL DMSO，置于搖床上振蕩0.5 h 充分溶解藍(lán)紫色結(jié)晶，酶標(biāo)儀在490 nm 波長處測定吸光度（A），計算細(xì)胞生長抑制率，公式為抑制率＝ ［1 -（A給藥-A空白溶劑） ／ （A空白對照-A空白溶劑）］ ×100%。

2.8.4 增殖抑制率測定 表3 顯示，不同質(zhì)量濃度莪術(shù)醇溶液及莪術(shù)醇固體脂質(zhì)納米?；鞈乙鹤饔靡欢螘r間后，Caski 細(xì)胞生長均受到抑制，隨著用藥量升高而更明顯，并且在用藥量相同的條件下作用時間延長時亦然，即呈明顯的量效和時效關(guān)系。另外，在相同用藥量的條件下莪術(shù)醇固體脂質(zhì)納米粒的抑制效果均高于莪術(shù)醇，作用48、72 h 后更明顯（P＜0.05，P＜0.01）。

表3 Caski 細(xì)胞抑制率測定結(jié)果（， n＝3）Tab.3 Results of inhibitory rate determination of Caski cells （， n＝3）

表3 Caski 細(xì)胞抑制率測定結(jié)果（， n＝3）Tab.3 Results of inhibitory rate determination of Caski cells （， n＝3）

注：與莪術(shù)醇比較，?P＜0.05，??P＜0.01。

3 討論

納米給藥系統(tǒng)已成為藥劑學(xué)研究熱點(diǎn)之一［15-16］，應(yīng)用于抗腫瘤藥物給藥時體現(xiàn)出巨大的優(yōu)勢［14］。本實(shí)驗(yàn)制備的莪術(shù)醇固體脂質(zhì)納米粒采用混合脂質(zhì)材料作為藥物載體，包封率達(dá)83.27%?？赡苁腔旌现|(zhì)載體可增加晶格混亂程度，使更多藥物被包裹進(jìn)入納米粒［17-18］。

體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，莪術(shù)醇及其固體脂質(zhì)納米粒對Caski 細(xì)胞生長的抑制具有時效和量效關(guān)系，以后者抑制效果更強(qiáng)，可能與納米粒增強(qiáng)莪術(shù)醇光穩(wěn)定性有關(guān)［19］，一方面固體脂質(zhì)納米粒對光的散射作用降低了莪術(shù)醇與光的接觸幾率；另一方面，固體脂質(zhì)納米粒對莪術(shù)醇包裹后降低了外部環(huán)境對其影響，從而提高了穩(wěn)定性。

體外釋藥實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，莪術(shù)醇固體脂質(zhì)納米粒具有明顯的緩釋特征［20］，與體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，可能是因?yàn)檩d藥納米粒高效擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞后可持續(xù)、緩慢地釋放藥物，從而有效抑制Caski腫瘤細(xì)胞生長。

對莪術(shù)油新劑型的研究較多，但由于它是一種混合物，不僅影響了制劑含藥量，也容易導(dǎo)致制劑穩(wěn)定性較差、產(chǎn)生毒性的問題［21］，故將有明確療效的單體（如莪術(shù)醇等） 進(jìn)行新制劑研究具有較大意義。今后，將把研究重點(diǎn)放在莪術(shù)醇固體脂質(zhì)納米粒凍干粉末的制備、表面修飾、作用機(jī)制［22］、體內(nèi)藥動學(xué)及抑瘤效果上，為相關(guān)制劑研發(fā)及臨床應(yīng)用提供資料。