徐開祥 劉志強(qiáng) 任亞東 孫秋艷

（1.揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司，江蘇 泰州 225321；2.揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)廣州海瑞藥業(yè)有限公司，廣東 廣州510663）

利伐沙班(Rivaroxaban)是新型抗凝藥物可以高選擇、直接抑制結(jié)合或游離狀態(tài)的Xa 因子，進(jìn)而中斷內(nèi)、外源性的凝血途徑，抑制凝血酶產(chǎn)生，并最終抑制血栓形成[1]。老年非瓣膜性心房顫動(dòng)患者采用利伐沙班抗凝治療的有效性及安全性較華法林高，更能有效降低患者的出血事件、不良反應(yīng)發(fā)生率，值得推廣[2]。適應(yīng)癥為：用于擇期髖關(guān)節(jié)或膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)成年患者，以預(yù)防靜脈血栓形成(VTE)。用于治療成人靜脈血栓形成(DVT)，降低急性 DVT 后 DVT 復(fù)發(fā)和肺栓塞（PE）的風(fēng)險(xiǎn)。用于具有一種或多種危險(xiǎn)因素（例如：充血性心力衰竭、高血壓、年齡≥75歲、糖尿病、卒中或短暫性腦缺血發(fā)作病史）的非瓣膜性房顫成年患者，以降低卒中和全身性栓塞的風(fēng)險(xiǎn)。本文采用反相色譜法建立了利伐沙班片異構(gòu)體含量檢測(cè)方法。

1 試藥與儀器

1.1 試藥

利伐沙班對(duì)照品，來源于USP，利伐沙班片及空白輔料片，由揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)廣州海瑞藥業(yè)有限公司提供；乙腈（色譜純）、水（純化水）。

1.2 儀器

高效液相色譜儀型號(hào)為Agilent 1260，電子天平型號(hào)為梅特勒XS250

2 異構(gòu)體測(cè)定方法

2.1 色譜條件

采用高效液相色譜法，以CHIRALPAK IC（4.6*250mm 5μm）為色譜柱，以乙腈為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為250nm，柱溫為25℃，流速為1.0mL∕min。

2.2 樣品配制

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液：取利伐沙班異構(gòu)體對(duì)照品約6mg，精密稱定，置250ml 量瓶中，用稀釋劑（乙腈:水=50:50）溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為利伐沙班異構(gòu)體儲(chǔ)備液；另取利伐沙班對(duì)照品約15mg，精密稱定，置10ml 量瓶中，精密加入利伐沙班異構(gòu)體儲(chǔ)備液1ml，用稀釋劑溶解并稀釋制成每1ml 中約含利伐沙班異構(gòu)體2.4μg、利伐沙班1.5mg 的混合溶液，作為系統(tǒng)適用性溶液。

供試品溶液：取本品細(xì)粉約640mg（約相當(dāng)于利伐沙班75mg），精密稱定，置50ml量瓶中，加稀釋劑適量，超聲30min使溶解并用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，即得每1ml 中約含利伐沙班1.5mg的供試品溶液。

對(duì)照溶液：精密量取供試品溶液5ml，置100ml 量瓶中，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照儲(chǔ)備液；精密量取對(duì)照儲(chǔ)備液3ml，置100ml量瓶中，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照溶液。

圖1 空白輔料色譜圖

圖2 利伐沙班異構(gòu)體色譜圖

靈敏度溶液：精密量取對(duì)照儲(chǔ)備液1ml，置100ml量瓶中，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，作為靈敏度溶液

2.3 異構(gòu)體測(cè)定

系統(tǒng)適用性溶液中，利伐沙班異構(gòu)體和利伐沙班的分離度應(yīng)不小于1.5；靈敏度溶液中，主峰的信噪比應(yīng)不小于10。

樣品測(cè)定：進(jìn)樣體積為20μL，按自身對(duì)照法計(jì)算本品異構(gòu)體含量。

3 方法學(xué)研究

3.1 專屬性試驗(yàn)

稱取空白輔料粉末約640mg，精密稱定，置50ml量瓶中，加稀釋劑適量，超聲30min 使溶解并用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，即得。以稀釋劑[乙腈:水=50:50]為空白溶劑；分別采集空白溶劑、空白輔料溶液、供試品溶液、對(duì)照溶液的圖譜。圖譜見下圖1～圖3，空白輔料溶液在供試品、對(duì)照品溶液的主峰位置無干擾峰，即輔料對(duì)異構(gòu)體測(cè)定無干擾。

3.2 檢測(cè)限和定量限

取對(duì)照品溶液，稀釋后進(jìn)樣，信噪比為10:1時(shí)為定量限，信噪比為3:1 時(shí)為檢測(cè)限，檢測(cè)限濃度為0.10201μg∕ml，檢測(cè)量為2.04ng，約相當(dāng)于供試品濃度0.007%；定量限濃度為0.34004g∕ml，約相當(dāng)于供試品濃度0.023%

3.3 線性與范圍

取利伐沙班異構(gòu)體對(duì)照品，配制成濃度分別為0.34μg∕mL、1.13μg∕mL、1.81μg∕mL、2.27μg∕mL、3.40μg∕mL、4.53μg∕mL 的利伐沙班異構(gòu)體溶液，進(jìn)樣，收集峰面積數(shù)據(jù)，結(jié)果見表1。

表1 線性結(jié)果

圖3 利伐沙班色譜圖

以利伐沙班異構(gòu)體濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行擬合，結(jié)果顯示，利伐沙班異構(gòu)體在0.34μg∕ml～4.53μg∕ml 的濃度范圍內(nèi)，與峰面積的響應(yīng)值線性相關(guān)，線性方程為y=71.2240x-0.6779，相關(guān)系數(shù)為r=0.99998。

3.4 準(zhǔn)確度

按50%、100%、120%三個(gè)濃度水平，稱取利伐沙班異構(gòu)體加入到供試品溶液中，配置方法同供試品溶液配制方法，采用本方法進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2 準(zhǔn)確度測(cè)定結(jié)果

結(jié)果顯示，在50%、100%、120%三個(gè)濃度水平下，平均回收率為101.2%，RSD 為0.6%（n=9），結(jié)果符合要求，說明方法具有良好的準(zhǔn)確度。

3.5 重復(fù)性

取同一批次，配置6份樣品，分別進(jìn)樣檢測(cè)，結(jié)果顯示，6份樣品的測(cè)定結(jié)果均在0.032%～0.035%之間，RSD為3.2%（n=6），異構(gòu)體測(cè)定方法的重復(fù)性較好。

3.6 溶液穩(wěn)定性

取供試品溶液 1 份，分別于配樣后 4h、8h、12h、16h、20h、24h進(jìn)樣，統(tǒng)計(jì)異構(gòu)體含量，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，樣品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

表3 溶液穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果

3.7 耐用性試驗(yàn)

取系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液、靈敏度溶液、對(duì)照溶液和供試品溶液，對(duì)色譜條件中的波長(zhǎng)、流速、柱溫進(jìn)行變動(dòng)，從分離度、靈敏度信噪比、異構(gòu)體含量結(jié)果各方面來考察該方法的耐用性，結(jié)果見表6。

表4 耐用性試驗(yàn)結(jié)果

從表格數(shù)據(jù)可以看出，改變波長(zhǎng)、流速、柱溫，系統(tǒng)適用性均符合要求，對(duì)異構(gòu)體檢測(cè)結(jié)果影響不大，該方法耐用性良好。

4 討論

4.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

利伐沙班的最大吸收波長(zhǎng)為250nm，故選擇250nm 作為利伐沙班的檢測(cè)波長(zhǎng)。

4.2 溶劑的選擇

崔萍等[3]建立了異構(gòu)體檢測(cè)方法，使用研創(chuàng)IB 手性柱，流動(dòng)相為正己烷(含0.1%三氟乙酸):異丙醇:乙醇(60∶20∶20)；張倩如等[4]也建立了異構(gòu)體檢測(cè)方法，方法為色譜柱為Chiralpak IA(250mm×4.6mm，5μm)，流動(dòng)相為100%甲醇，流速為1.0ml∕min，檢測(cè)波長(zhǎng)為250nm，柱溫為40℃。上述方法均針對(duì)本品種原料藥建立檢測(cè)方法，使用均為正相色譜法，正相色譜法存在液相切換復(fù)雜，靈敏度較低。本品制劑中存在大量的輔料，輔料在有機(jī)溶劑存在溶解性問題，需要水參與來溶解片劑輔料，但正相系統(tǒng)不能兼容水，可能會(huì)損壞正相色譜柱。因此在方法建立上，建立了反相色譜法來兼容

5 結(jié)語

本方法測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，精密度高，耐用性良好，可以作為利伐沙班片中異構(gòu)體含量測(cè)定方法。