陳文思，邱樹毅，李朝云，于院國(guó)，王曉丹

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550025；2.貴州大學(xué)貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng) 550025）

陳皮,首現(xiàn)于唐代孟詵的《食療本草》中,始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,屬于上品?！睹t(yī)別錄》“下氣,止嘔咳,治氣沖胸中,吐逆霍亂,療脾不能消谷,止瀉,除膀胱留熱停水,五淋,利小便,去寸白蟲,久服輕身長(zhǎng)年”[1]；唐《備急千金要方》記載:“去赤脈,去瓤”,這是陳皮最早的處理方式。中國(guó)藥典中，陳皮分為“陳皮”與“廣陳皮”，是蕓香科植物橘（Citrus reticulateBlanco）及其栽培變種后的干燥成熟果皮，分布于廣東、四川、江西、湖北等地。陳皮辛苦，性溫，歸脾、肺經(jīng)[2]。有理氣健脾，燥濕化痰、防暈車、治咳嗽和消積食等藥用價(jià)值[3-4]，并且在美容、健美上面也有獨(dú)特的作用[5-6]。陳皮主要含有揮發(fā)油、黃酮類化合物

和其他微量元素[7]，目前在臨床上主要用于咳嗽、消化不良、厭食等疾病。在開發(fā)利用方面涉及藥品、調(diào)味品、藥膳及保健食品等,是極具開發(fā)前景的中藥材[8]。主要的制作方法是炮制[9]和加壓蒸制[10]等。實(shí)驗(yàn)利用陳皮作為原料進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵，通過(guò)檢測(cè)期間黃酮含量來(lái)確定最佳工藝。對(duì)陳皮中化合物的優(yōu)化利用具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑

原料：陳皮，購(gòu)于貴州省貴陽(yáng)市花溪區(qū)星力超市；紅糖，購(gòu)于貴州省貴陽(yáng)市花溪區(qū)星力超市；麥芽汁，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。

菌種：畢赤氏酵母，本實(shí)驗(yàn)室編號(hào)FKBL2.0008；東方伊薩酵母，本實(shí)驗(yàn)室編號(hào)FKBL2.0002。

試劑及耗材：乙酸（分析純），天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；三氯化鋁（分析純），天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；苯酚，成都金山化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉，成都金山化學(xué)試劑有限公司；酒石酸鉀鈉，成都金山化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司；7890氣相色譜儀，安捷倫科技有限公司；質(zhì)譜儀，安捷倫科技有限公司；PAL RSI 多功能自動(dòng)進(jìn)樣器，瑞士斯特斯分析儀器有限公司；SPME 萃取頭，型號(hào)57912U 涂層50/30 μm DVB/CAR/PDMS,美國(guó)Supelo公司；超凈工作臺(tái)；恒溫培養(yǎng)箱，MJX-250BZ 型上海迅博實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；生物顯微鏡BM1000型，濟(jì)南醫(yī)療器械有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理方法

陳皮粒度對(duì)陳皮黃酮提取的影響：分別取過(guò)10～20 目、20～30 目、30～40 目、40～50 目的陳皮粒，冷卻后測(cè)其黃酮含量。

溫度對(duì)陳皮黃酮提取的影響：取過(guò)20目的陳皮粒10 g，加入蒸餾水100 mL，分別在50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃下水浴加熱50 min，然后冷卻至室溫，測(cè)其黃酮含量。

加熱時(shí)間對(duì)陳皮黃酮提取的影響：取過(guò)20目陳皮粒5 g，加入100 mL蒸餾水，分別微沸處理10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min，然后冷卻至室溫測(cè)其黃酮含量。

酵母菌的確定：對(duì)FKBL2.0008 與FKBL2.0008發(fā)酵的陳皮酒進(jìn)行感官品評(píng)，篩選最佳酵母。

酵母菌添加量的確定：通過(guò)對(duì)發(fā)酵過(guò)程中還原糖濃度與酒精度的變化來(lái)確定酵母的最佳添加量。

發(fā)酵周期的確定：通過(guò)對(duì)發(fā)酵過(guò)程中還原糖的變化狀況來(lái)判斷發(fā)酵的進(jìn)行程度。

料液比對(duì)陳皮黃酮提取的影響：分別取過(guò)10目的陳皮粒1 g、3 g、5 g、7 g、9 g、11 g、13 g，加入100 mL蒸餾水微沸處理50 min，然后冷卻至室溫，測(cè)其黃酮含量。

糖水比的確定：取紅糖10 g、20 g、30 g、40 g、50 g、60 g、70 g，分別加入100 mL蒸餾水，高溫滅菌后接種FKBL2.0008酵母菌，加入無(wú)菌水200 mL，在恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵處理，在1 d、2 d、3 d、4 d、5 d用顯微觀察計(jì)數(shù)。

黃酮的測(cè)定方法，還原糖的測(cè)定方法。

1.3.2 陳皮酒工藝陳皮預(yù)處理→酵母液的制備→糖水的制備→混合發(fā)酵→過(guò)濾→蒸餾

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)處理粒度的確定（圖1）

陳皮中黃酮的提取效果跟陳皮的粒度大小有關(guān)，在不同的目數(shù)下，陳皮與水的接觸比表面積不同，從而影響了黃酮的提取效果，但是陳皮中富含果膠，粒度過(guò)小會(huì)使陳皮粒之間產(chǎn)生黏著現(xiàn)象，使之在水中產(chǎn)生小部分絮凝，達(dá)不到高效提取黃酮的目的，所以根據(jù)圖1所示，最佳的破碎粒度為20～30目。

2.2 預(yù)處理溫度的確定（圖2）

黃酮類化合物是一類存在于自然界的、具有2-苯基色原酮結(jié)構(gòu)的化合物，它的結(jié)構(gòu)式具有多個(gè)苯環(huán)，而苯環(huán)不溶于水，易溶于有機(jī)溶劑。所以，水提法不容易造成陳皮中黃酮的流失。加熱能讓陳皮的纖維結(jié)構(gòu)，果皮松軟度發(fā)生改變，從而使黃酮等化學(xué)物質(zhì)能更好的析出。而加熱溫度并不是越高越好，超過(guò)一定范圍，溫度的變化會(huì)引起黃酮類化合物的損失[11]。所以，根據(jù)圖2 可知，陳皮的最佳處理溫度范圍是20～30 ℃。

2.3 預(yù)處理加熱時(shí)間的確定（圖3）

從圖3 可以看出，黃酮的提取效果在30 min 時(shí)達(dá)到最高，后期呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。導(dǎo)致這個(gè)現(xiàn)象的原因可能是陳皮黃酮在長(zhǎng)時(shí)間的浸提過(guò)程中與水中或者陳皮中的化合物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致黃酮的含量處于一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程，但變化范圍不大，最佳的處理時(shí)間是30 min。在此時(shí)間黃酮的檢出量最多，所以陳皮預(yù)處理的最佳處理時(shí)間是30 min。

2.4 酵母菌的確定（表1、圖4、圖5）

為了使品評(píng)結(jié)果普遍化和隨機(jī)化，本實(shí)驗(yàn)采取了抽樣調(diào)查的方法，分別選取了專業(yè)老師3人，專業(yè)研究生7人，本專業(yè)學(xué)生40人，隨機(jī)選取非本專業(yè)學(xué)生50 人進(jìn)行了感官品評(píng)。并根據(jù)白酒品評(píng)方法設(shè)立此次品評(píng)標(biāo)準(zhǔn)[12]如表1 所示，最后根據(jù)計(jì)算平均值公式得到感官指標(biāo)各項(xiàng)平均值見(jiàn)圖4和圖5，由于本試驗(yàn)是陳皮的液態(tài)發(fā)酵，所以兩種酵母菌產(chǎn)出的酒的口味都較薄，但不影響酵母菌的選擇。所以，對(duì)比圖4和圖5得出最佳酵母菌是FKBL2.0008。

2.5 酵母添加量確定（圖6、圖7）

本實(shí)以酵母添加量為自變量，還原糖變化為因變量。圖6是初始發(fā)酵液中還原糖吸光度，圖7是9 d時(shí)發(fā)酵液中還原糖濃度，由于酵母和所處環(huán)境相同，所以可以根據(jù)比色法來(lái)測(cè)定發(fā)酵液的還原糖量從而確定發(fā)酵進(jìn)行的狀態(tài)。對(duì)比圖6 和圖7 得到最佳酵母添加量為18%。

2.6 發(fā)酵時(shí)間的確定（圖8）

酵母的代謝過(guò)程是消耗糖的，本實(shí)驗(yàn)以糖殘余量來(lái)判斷發(fā)酵的進(jìn)行程度，在殘?zhí)橇康陀?0 mg/mL時(shí)，酵母對(duì)糖的利用基本上很低了，所以可以確定發(fā)酵結(jié)束，根據(jù)圖8 得知，在第15 天時(shí)殘?zhí)橇吭?0 mg/mL左右，所以得到最佳發(fā)酵周期為16 d。

2.7 料液比的確定（圖9）

陳皮預(yù)處理過(guò)程中料液的比例很大程度上影響了陳皮黃酮的提取效率，從圖9可以看出，隨著料液比的增加，黃酮的浸提率是先增加后減少的，在料液比為5%時(shí)的黃酮提取效率最高。因此本試驗(yàn)選取的料液比為5%。

2.8 糖水比的確定（圖10）

酒精發(fā)酵的原理是，酵母在無(wú)氧的培養(yǎng)條件下，酵母菌(或細(xì)菌)利用葡萄糖發(fā)酵生成酒精和二氧化碳，而本試驗(yàn)用紅糖作為發(fā)酵碳源。通過(guò)紅糖的分解代謝，從而產(chǎn)生乙醇。所以，糖的濃度決定了最后成品酒的酒精度。在不同糖濃度中酵母的生長(zhǎng)代謝活力是不一樣的，高濃度的糖會(huì)影響酒精發(fā)酵[13]，所以本試驗(yàn)以糖濃度梯度為自變量，以酵母數(shù)為因變量，得到糖濃度與酵母生長(zhǎng)的函數(shù)關(guān)系如圖10，最終得到陳皮酒的最佳糖水比為40%。

2.9 黃酮測(cè)定方法（圖11）

本實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[14]中的黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖11 所示，其回歸方程為y=20.755x-0.3117，R2=0.9989。

2.10 還原糖測(cè)定方法（圖12）

本實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[15]中還原糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖12，其回歸線方程為y=0.6496x-0.0402，R2=0.9951。

2.11 成品酒的成分檢測(cè)（圖13）

3 結(jié)論

以陳皮為原料從兩種酵母中選出最佳酵母為畢赤氏酵母，通過(guò)實(shí)驗(yàn)對(duì)陳皮預(yù)處理、料液比、酵母接種量、糖水比做出分析得到的最佳工藝為：陳皮破碎過(guò)20～30 目，加入適量水30 ℃加熱30 min，料液比5%，接種量18%，糖水比40%。酒體澄清透明，具有陳皮的典型風(fēng)味。通過(guò)質(zhì)譜庫(kù)檢索和人工圖譜分析，陳皮酒中共鑒定83個(gè)化合物（表2），其中酯類22個(gè)，醇類12 個(gè)，烯類31 個(gè)，酸3 個(gè)，其他化合物16個(gè)。主要成分包括檸檬烯（32.244%）、癸酸乙酯(17.877%)、γ-松油烯(6.491%)、1-乙烯基-1-甲基-2,4-雙（1-甲基乙烯基環(huán)己烯）、環(huán)己烯(5.923%)、十二烷酸乙酯(4.331%)、蛇麻烯(2.121%)、α-金合歡烯(3.723%)等化學(xué)物質(zhì)，其中天然烷烯類化合物含量最為豐富，酯類物質(zhì)其次。陳皮酒中富含的酯類和醇類物質(zhì)，有一定的開發(fā)和利用前景，開展陳皮發(fā)酵酒的工藝研究有利于陳皮下一步的開發(fā)與利用。

表2 GC-MS方法對(duì)陳皮酒的揮發(fā)性香氣成分分析

續(xù)表2 GC-MS方法對(duì)陳皮酒的揮發(fā)性香氣成分分析