林菊珊 蔡 楠 楊代和△ 張世欣 吳雅婷 謝步霓 潘曉鳴 廖遠生

肢體疼痛是腦缺血后常見并發(fā)癥，發(fā)生率高達30%以上[1]，嚴重影響患者生活質(zhì)量。肢體疼痛的產(chǎn)生與神經(jīng)損傷密切相關(guān)[2]。前期研究證明，穴位電刺激可抑制大鼠脊髓背角及脊神經(jīng)后根細胞凋亡，緩解疼痛癥狀[3]。臂叢神經(jīng)是上肢疼痛傳導(dǎo)通路，目前穴位電刺激是否影響臂叢神經(jīng)細胞凋亡尚未知，本研究通過腦缺血再灌注大鼠(MACO)模型，觀察穴位電刺激曲池、足三里對大鼠臂叢組織中Caspase-3、Bax和Bcl-2表達及神經(jīng)細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 一般資料 120只雄性SD大鼠(400～450 g)隨機分為3組，每組40只，假手術(shù)組(S組)、缺血再灌注組(I/R組)和電刺激組(EA組)。3組都用10%水合氯醛0.5 ml腹腔注射麻醉，消毒大鼠頸部皮膚，從頸部正中線作縱行切口(約2 cm)，鈍性剝離，暴露左側(cè)頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈。S組，逐層縫合皮下筋膜及皮膚，未進行其他處理； I/R和EA組造腦缺血再灌注模型，在頸總動脈近分叉位置剪開“V”形小口，將3-0單股尼龍線從小口插入(提前在尼龍線上做好刻度標記，頭端磨鈍，并用10%L-賴氨酸浸泡)，經(jīng)頸總動脈分叉處插入頸內(nèi)動脈，以頸動脈分叉為起始，插入深度為(1.5±0.5) cm，縫合切口，栓塞1 h后取出尼龍線，蘇醒后提尾，以右前肢屈曲或爬行向右側(cè)劃圈為腦缺血再灌注造模成功標志，I/R組未進行其他處理，EA組給予“曲池”“足三里”穴位電刺激治療。分別于實驗前(T0)及實驗第1天(T1)、3天(T2)、7天(T3)、14天(T4)，通過電子測痛儀觀察并記錄大鼠疼痛閾值。于T1、T2、T3和T4各取10只大鼠處死，取出右側(cè)臂叢神經(jīng)，采用Western blot檢測大鼠臂叢神經(jīng)中Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白的表達。

1.2 方法

1.2.1 穴位電刺激方法 自然光照，室溫控制(22±3) ℃。每天9:00—9:30和15：00—15:30將3組大鼠放置于自制固定裝置，暴露四肢及尾部。馬冉冉等[4]研究認為通過電針刺激患側(cè)”曲池”“足三里”，可抑制腦缺血再灌注損傷后炎癥級聯(lián)反應(yīng)，本研究中EA組選取上述穴位,將華佗牌28號1寸毫針(蘇州醫(yī)療用品有限公司)插入患側(cè)“曲池”“足三里”，入皮5 mm，毫針接LH-800型韓式穴位神經(jīng)刺激儀(北京航空航天大學(xué)制造)，用疏密波(頻率2～15 Hz，強度1 mA)進行穴位電刺激。從造模成功后第1天開始，每天上午、下午各1次，每次30 min。S組及I/R組則不進行穴位電刺激。

1.2.2 觀察指標 ①疼痛閾值檢測。用Von Frey電子測痛儀(IITC Life Science公司，美國)檢測各組大鼠造模前、造模后T1、T2、T3和T4時患側(cè)足底機械縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold, MWT)[5]的變化，記錄各組大鼠疼痛閾值。②Western blot檢測Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表達。取標本放入組織裂解液中勻漿，離心后取上清，即為組織塊用冷TBS洗滌3次，去除血污，剪成小塊置于勻漿器上。加入10倍組織體積本試劑(使用前數(shù)分鐘配制，cocktail+磷酸化蛋白酶抑制劑)，徹底勻漿；將勻漿液轉(zhuǎn)移至1.5 ml離心管中振蕩，冰浴30 min；以12000轉(zhuǎn)離心5 min，收集上清為總蛋白溶液；灌膠，上樣加足夠電泳液后電泳，待電泳至溴酚藍剛出時終止電泳，進行轉(zhuǎn)膜；在脫色搖床上將轉(zhuǎn)好的膜用5%的脫脂牛奶(0.5%TBST配)封閉1 h。稀釋一抗(TBST溶解的5%脫脂牛奶)，4 ℃過夜。在TBST脫色搖床上洗3次，每次5 min。用TBST稀釋二抗3000倍，室溫下孵育30 min，在室溫下在TBST脫色搖床上洗3次，每次5 min。將膜蛋白面朝上與混合液充分接觸，1～2 min后，去盡殘液，包好后放入X光片夾中曝光。將膠片掃描，用Alpha軟件分析目標帶的光密度值，用相對灰度值代表蛋白表達情況(相對灰度值=待測蛋白灰度值/β-actin灰度值)。

1.2.3 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)用SPSS 17.0進行統(tǒng)計分析，組內(nèi)比較采用配對樣本t檢驗，組間比較采用成組樣本t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 一般行為學(xué)觀察 3組大鼠一般情況良好，體質(zhì)量穩(wěn)定上升，3組比較無顯著差異性表現(xiàn)。I/R組和EA組大鼠均出現(xiàn)提尾右前肢屈曲或爬行向右側(cè)劃圈，但EA組大鼠患側(cè)前肢屈曲及爬行向右劃圈等癥狀得到一定改善。I/R組大鼠死亡2只，EA組大鼠死亡1只，實驗過程中對應(yīng)補齊數(shù)據(jù)。

2.2 疼痛閾值結(jié)果 3組大鼠實驗前MWT無明顯差異性(P>0.05)；S組MWT實驗前后無明顯差異(P>0.05)；與組內(nèi)T0比較，T1、T2、T3和T4時I/R組和EA組MWT更低(P<0.01)；與S組比較，T1、T2、T3和T4時I/R組和EA組MWT更低(P<0.01)；與I/R組比較，T3和T4時EA組MWT更高(P<0.05或0.01)。見圖1。

圖1 各組大鼠MWT比較

2.3 Western blot檢測臂叢神經(jīng)細胞Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表達結(jié)果

2.3.1 臂叢神經(jīng)細胞Caspase-3蛋白表達結(jié)果 S組大鼠臂叢神經(jīng)細胞Caspase-3蛋白表達實驗前后無差異(P>0.05)；與組內(nèi)T1比較，T2、T3和T4時I/R組和EA組Caspase-3蛋白表達增強(P<0.01)；與S組比較，T1、T2、T3和T4時I/R組和EA組Caspase-3蛋白表達更高(P<0.01)；與I/R組比較，T3和T4時EA組Caspase-3蛋白表達更低(P<0.01)。見圖2。

2.3.2 臂叢神經(jīng)細胞Bax蛋白表達結(jié)果 S組大鼠臂叢神經(jīng)細胞Bax蛋白表達實驗前后無差異(P>0.05)；與組內(nèi)T1比較，T2、T3和T4時I/R組和EA組Bax蛋白表達增強(P<0.05或0.01)；與S組比較，T1、T2、T3和T4時I/R組和EA組Bax蛋白表達更高(P<0.01)；與I/R組比較，T3和T4時EA組Bax蛋白表達更低(P<0.01)。見圖3。

圖2 各組大鼠Caspase-3比較

圖3 各組大鼠Bax比較

2.3.3 臂叢神經(jīng)細胞Bcl-2蛋白表達結(jié)果 S組大鼠臂叢神經(jīng)細胞Bcl-2蛋白表達實驗前后無差異(P>0.05)；與組內(nèi)T1比較，T2、T3和T4時I/R組和EA組Bcl-2蛋白表達降低(P<0.05或0.01)；與S組比較，T1、T2、T3和T4時I/R組和EA組Bcl-2蛋白表達降低(P<0.01)；與I/R組比較，T3和T4時EA組Bcl-2蛋白表達更高(P<0.01)。見圖4。

圖4 各組大鼠Bcl-2比較

3 討論

大鼠臂叢神經(jīng)由C5～8和T1前支組成，包括傳入和傳出神經(jīng)纖維，支配前肢的感覺和運動功能。腦缺血后引起對側(cè)肢體癱瘓和功能障礙，本研究采用左側(cè)頸內(nèi)動脈插入尼龍線，制作腦缺血/再灌注大鼠模型，表現(xiàn)右前肢偏癱，在運動中偏癱肢體自我保護能力差，并且容易受傷，導(dǎo)致偏癱側(cè)肢體臂叢神經(jīng)損傷。腦缺血/再灌注損傷，導(dǎo)致交感神經(jīng)和傳入神經(jīng)偶聯(lián)會產(chǎn)生惡性循環(huán)，增強患側(cè)肢體交感神經(jīng)的興奮性，造成局部組織發(fā)生營養(yǎng)障礙，引發(fā)患側(cè)肢體疼痛[6]。袁群芳等[7]研究認為，臂叢神經(jīng)損傷，可以導(dǎo)致脊髓前角運動神經(jīng)元細胞的損傷及死亡，并對前后角的功能起到了損傷作用，發(fā)生神經(jīng)性疼痛。本研究發(fā)現(xiàn)，穴位電刺激組比腦缺血/灌注組疼痛閾值高，與前期研究相符，穴位電刺激能降低腦缺血/灌注損傷大鼠的脊髓背角神經(jīng)細胞凋亡，穩(wěn)定脊髓背角神經(jīng)細胞功能的作用，調(diào)節(jié)疼痛信息的傳遞，減緩神經(jīng)病理性疼痛發(fā)作[3]；也可能與穴位電刺激可以下調(diào)中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)、中縫背核、中縫大核中孤啡肽受體mRNA的表達，提高體內(nèi)腦啡肽和內(nèi)啡肽效力，起到鎮(zhèn)痛效果有關(guān)[8]。

中醫(yī)學(xué)認為，疼痛的病機在于各種原因造成的氣血運行障礙，“不通則痛”；氣血虛少，“不榮則痛”。針刺是中醫(yī)的特色療法，電刺激穴位能有效緩解急慢性疼痛，療效得到國內(nèi)外認可?！扒亍薄白闳铩毖ㄊ侵委熤w疼痛的常用穴位，電刺激穴位鄰近神經(jīng)以及周圍血管，改善局部血液循環(huán)，減少炎癥和滲出，緩解疼痛癥狀[9]。

Bax和Bcl-2基因在細胞凋亡調(diào)控過程中是一對重要的調(diào)控基因，它們功能相互對立，Bax促進細胞凋亡，而Bcl-2則可通過多種途徑抑制細胞凋亡，而Caspase-3在細胞凋亡過程中則是關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行蛋白酶。有文獻報道，電針對腦缺血后內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的增值、分化和修復(fù)方面有一定的調(diào)節(jié)作用，針刺治療可下調(diào)Bax的表達，上調(diào)Bcl-2水平，提高Bcl-2/Bax的比值，抑制Caspase-3的活性，抑制神經(jīng)細胞凋亡[10，11]。Wang Y等[12]研究認為神經(jīng)損傷可促使小膠質(zhì)細胞活化和促炎細胞因子IL-1β釋放，誘發(fā)神經(jīng)源性疼痛超敏反應(yīng)，產(chǎn)生持續(xù)性神經(jīng)病理性疼痛，2 Hz穴位電刺激能增加脊髓神經(jīng)傳導(dǎo)通路上α-7煙堿乙酰膽堿釋放，抑制脊髓小膠質(zhì)細胞活化和促炎細胞因子IL-1β釋放，從而改善大鼠腦缺血再灌注損傷，促進神經(jīng)細胞修復(fù)，起到鎮(zhèn)痛效果。本研究2-15 Hz穴位電刺激組比腦缺血/再灌注組臂叢神經(jīng)細胞中Caspase-3和Bax表達更少，Bcl-2表達更多，凋亡細胞更少，表明穴位電刺激可以減少腦缺血/再灌注損傷大鼠臂叢神經(jīng)細胞凋亡，并且可能通過臂叢神經(jīng)α-7煙堿乙酰膽堿釋放，抑制臂叢神經(jīng)小膠質(zhì)細胞活化和促炎細胞因子IL-1β釋放，從而促進腦缺血/再灌注損傷大鼠臂叢神經(jīng)修復(fù)，以及癱瘓肢體康復(fù)。

總之，對腦缺血/再灌注損傷大鼠“曲池”和“足三里”穴位進行電刺激，可以提高疼痛閾值，緩解疼痛，減少臂叢神經(jīng)凋亡，促進臂叢神經(jīng)修復(fù)，可能與調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白Casepase-3、Bax和Bcl-2的表達有關(guān)，但其中詳細的細胞分子機制還有待進一步深入研究。