茍繼周，李曉星，孫 炎，張鴻英，彭 程，趙 霞，孫宜康，喻 宏，羅偉仁

病理科保存了大量的甲醛固定石蠟包埋(formalin fixed and paraffin embedded, FFPE)組織，這些樣本是發(fā)現(xiàn)生物分子標(biāo)志物有價(jià)值的潛在資源。病理工作者通過(guò)FFPE組織樣本獲取患者的形態(tài)學(xué)、遺傳學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和表觀遺傳學(xué)信息，為臨床醫(yī)師提供與精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)相關(guān)的信息[1-2]。然而，在組織處理過(guò)程中若未進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)固定，則無(wú)法準(zhǔn)確檢測(cè)突變，因?yàn)閺腇FPE組織中提取的DNA是片段化的，可能含有序列假象，在腫瘤異質(zhì)性的背景下，序列假象很難與真正的突變區(qū)分[3-5]。因此，要掌握甲醛固定過(guò)程是滲透、結(jié)合和交聯(lián)三位一體理論，全面了解和認(rèn)識(shí)FFPE標(biāo)本對(duì)下游基因和蛋白分子檢測(cè)的影響，在臨床和科研工作中盡可能做到減少FFPE標(biāo)本對(duì)下游檢測(cè)的影響[6]。

1 FFPE標(biāo)本對(duì)蛋白質(zhì)檢測(cè)的影響

影響蛋白質(zhì)檢測(cè)從“熱缺血”就已經(jīng)開(kāi)始。在手術(shù)期間，為控制出血用血管鉗夾住血管，組織的血液供應(yīng)被切斷，便發(fā)生缺氧、缺血和代謝應(yīng)激，可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解而發(fā)生改變。一旦組織離體后，電解質(zhì)缺乏、細(xì)胞代謝產(chǎn)物積累和溫度變動(dòng)等因素會(huì)影響生物分子水平的變化，包括潛在的蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物，因此，冷缺血時(shí)間是決定組織是否適用于免疫檢測(cè)的關(guān)鍵因素[7]。冷缺血對(duì)檢測(cè)的影響還與所檢測(cè)蛋白質(zhì)生物特性有關(guān)。比如磷酸化位點(diǎn)和磷蛋白水平在5～20 min冷缺血后，就有顯著改變[7]；而HER-2在延遲2～3 h后固定，F(xiàn)ISH信號(hào)和免疫組化染色結(jié)果均會(huì)減弱。在工作中，發(fā)現(xiàn)同一例乳腺癌標(biāo)本取材的組織塊中，其中一塊組織取材較大，腫瘤位于組織塊中心，周圍為大量致密的纖維結(jié)締組織包繞(圖1)；另一塊組織取材較小(圖2)。在實(shí)驗(yàn)條件相同的情況下用免疫組化染色檢測(cè)HER-2表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)組織較大者為陰性(圖3)，而組織較小者為陽(yáng)性(圖4)，分析原因可能是由于甲醛不能及時(shí)滲透到腫瘤組織所致。當(dāng)然，不能排除腫瘤組織中HER-2表達(dá)的異質(zhì)性。

一般而言，對(duì)于蛋白質(zhì)組學(xué)的檢測(cè)，在環(huán)境溫度下固定6～24 h免疫組化染色效果最佳。與固定1天的病理標(biāo)本相比，固定2天導(dǎo)致質(zhì)譜光譜減少，固定4天后可識(shí)別的蛋白質(zhì)更少。由此可見(jiàn)，更長(zhǎng)時(shí)間固定明顯影響檢測(cè)結(jié)果。也就是說(shuō)，隨著組織在甲醛中固定時(shí)間的延長(zhǎng)，許多抗原的表達(dá)逐漸喪失。此外，類似研究表明，組織在甲醛中固定3天后，有部分抗原染色明顯減少；固定7天后有更多的抗原丟失；固定14天后大多數(shù)抗原無(wú)法檢測(cè)到[7]。

大多數(shù)蛋白質(zhì)含有蛋白質(zhì)翻譯后修飾(PTM)，如糖基化、磷酸化和硫酸化等等。其中蛋白質(zhì)磷酸化是調(diào)節(jié)和控制蛋白質(zhì)活力和功能最基本、也是最重要的機(jī)制。然而，磷酸化蛋白質(zhì)很不穩(wěn)定，可在冷缺血時(shí)間30 min內(nèi)發(fā)生降解。有一些磷酸化蛋白質(zhì)(如p-AKT、p-ERK1/2、p-Tyrosine和p-MET等)相當(dāng)不穩(wěn)定，在冷缺血1～2 h內(nèi)抗原性會(huì)喪失。大多數(shù)磷蛋白隨著固定時(shí)間的增加，表位丟失趨勢(shì)明顯。當(dāng)然，有一些磷酸表位(如p-JAK2和p-ER)仍然可以在輔助診斷中常規(guī)使用[8]。

2 FFPE標(biāo)本對(duì)DNA檢測(cè)的影響

甲醛固定對(duì)DNA會(huì)造成損傷，其損傷的類型有：甲醛會(huì)引起DNA堿基與附近組蛋白的交聯(lián)、DNA片段化、胞嘧啶堿基脫氨基，導(dǎo)致C->T突變以及脫堿基的產(chǎn)生等[3,9-10]。其中，DNA堿基與附近組蛋白的交聯(lián)是甲醛固定中DNA損傷的主要形式，會(huì)引起DNA的構(gòu)象變化，降低雙鏈DNA的穩(wěn)定性而導(dǎo)致DNA部分變性。

隨著蠟塊儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)和組織固定中甲醛pH值的降低，組織中DNA的斷裂增加，DNA片段化增多[3]。FFPE中DNA的片段化對(duì)基因檢測(cè)的影響主要有：(1)直接減少了可用于PCR擴(kuò)增的模板量；(2)通過(guò)降低Taq DNA聚合酶的保真性導(dǎo)致擴(kuò)增后DNA序列假象；(3)降低PCR的擴(kuò)增效率引起PCR檢測(cè)失敗[11]。此外，DNA中的無(wú)堿基位點(diǎn)使雙螺旋結(jié)構(gòu)極其不穩(wěn)定，導(dǎo)致DNA的局部變性[3]。

①A①B②A②B③④

圖1較大塊乳腺癌組織：A.乳腺癌組織HE染色；B.A圖方框中的高倍圖圖2較小塊乳腺癌組織：A.乳腺癌組織HE染色；B.A圖方框中的高倍圖圖3HER-2在大塊乳腺癌組織中呈陰性，EliVision法圖4HER-2在小塊乳腺癌組織中呈陽(yáng)性，EliVision法

現(xiàn)有文獻(xiàn)表明，死后間隔時(shí)間、冷缺血、樣本大小、脫鈣方法、固定方法均可影響FFPE標(biāo)本中DNA的分析。其中固定方法包括是否使用緩沖甲醛、固定時(shí)間和溫度以及是否使用超聲波或微波輻射加速甲醛的組織滲透。盡管有以上這些因素影響DNA分析，在實(shí)際工作中，只要按照標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行固定和保存，手術(shù)切除和活檢標(biāo)本中均能提取足夠數(shù)量和高質(zhì)量的DNA用于NGS測(cè)序[10]。

3 FFPE標(biāo)本對(duì)RNA檢測(cè)的影響

美國(guó)國(guó)家癌癥研究所進(jìn)行了生物樣本預(yù)分析變量的研究，以確定甲醛固定和延遲固定對(duì)核酸分析的影響。通過(guò)對(duì)固定于不同延遲時(shí)間FFPE樣本和匹配快速冷凍樣本進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及小RNA的分析，發(fā)現(xiàn)與快速冷凍樣本相比，甲醛固定改變了RNA-seq捕獲的大多數(shù)基因內(nèi)含子、外顯子、未翻譯RNA的相對(duì)比例[12]。

RNA質(zhì)量主要通過(guò)以下三種方法評(píng)估：RNA完整性編號(hào)(RIN)、DV200(評(píng)估超過(guò)200個(gè)核苷酸的RNA片段的百分比)和基于qRT-PCR的系統(tǒng)(通過(guò)核苷酸長(zhǎng)度的比值分析來(lái)評(píng)估質(zhì)量)。采用DV200和qRT-PCR系統(tǒng)評(píng)估發(fā)現(xiàn)：長(zhǎng)時(shí)間固定于甲醛(72h)可顯著降低RNA質(zhì)量。但是，通過(guò)RIN值并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)RNA片段化的這些差異，提示需要注意用RIN作為FFPE質(zhì)量度量的有效性問(wèn)題。與術(shù)中快速冷凍相比，F(xiàn)FPE對(duì)RNA質(zhì)量具有顯著影響[13]。

文獻(xiàn)表明，延遲固定和脫鈣方法可影響FFPE中特異性標(biāo)志物RNA的完整性。影響RNA檢測(cè)的固定方法包括固定液是否為緩沖液、固定溫度和持續(xù)時(shí)間以及加速甲醛滲透到組織中的方法。就RNA分析可接受的固定持續(xù)時(shí)間而言，大多數(shù)研究認(rèn)為8～48 h適合于ISH和qRT-PCR分析，但延長(zhǎng)固定時(shí)間對(duì)RNA分析是不利的。然而，對(duì)于固定持續(xù)時(shí)間較短(6 h)是否影響檢測(cè)存在一些分歧。與環(huán)境溫度固定相比，37 ℃固定可導(dǎo)致RNA質(zhì)量較差，4 ℃固定是否優(yōu)于或相當(dāng)于與室溫固定的研究并不一致。

4 FFPE標(biāo)本對(duì)miRNA檢測(cè)的影響

miRNA是一類長(zhǎng)度為18～25個(gè)核苷酸的小RNA，其在細(xì)胞內(nèi)具有多種重要的調(diào)節(jié)作用。通過(guò)與信使RNA(mRNA)的物理相互作用抑制基因表達(dá)，廣泛參與調(diào)節(jié)健康或疾病狀態(tài)中細(xì)胞的功能，單個(gè)miRNA能夠調(diào)節(jié)數(shù)百種mRNA。FFPE標(biāo)本檢測(cè)miRNA盡管不作為常規(guī)用于臨床診斷，但由于組織原位分析miRNA的特性與組織學(xué)診斷疾病直接相關(guān)，有望作為形態(tài)學(xué)、蛋白質(zhì)表達(dá)、轉(zhuǎn)錄譜和DNA序列分析有益補(bǔ)充，成為臨床醫(yī)師和病理學(xué)家的重要輔助手段。因此，對(duì)組織中miRNA的分析不僅可以發(fā)現(xiàn)與特定疾病狀態(tài)相關(guān)的信息，還可能會(huì)成為預(yù)測(cè)患者預(yù)后的標(biāo)志物[14]。

與其他核酸相比，miRNA比較穩(wěn)健，能更好地耐受固定的影響以及抵抗常規(guī)處理和儲(chǔ)存條件[14]。在甲醛中固定2～3天，miRNA均始終能檢測(cè)到，但與配對(duì)術(shù)中快速冷凍對(duì)照相比，在延遲12 h后固定顯示出增加的變化[13]。另外研究發(fā)現(xiàn)，與配對(duì)冷凍標(biāo)本相比，甲醛固定后miRNA平均表達(dá)水平降低，隨著固定時(shí)間延長(zhǎng)至6天，這種影響變得更明顯[14]，總之，標(biāo)準(zhǔn)化的甲醛固定時(shí)間是減少影響的前提條件。

由于腫瘤組織的異質(zhì)性，腫瘤細(xì)胞周圍有大量的間質(zhì)細(xì)胞；仔細(xì)挑選腫瘤細(xì)胞群是組織中miRNA分析至關(guān)重要的環(huán)節(jié)[14]。研究表明，從FFPE樣品中提取miRNA的方法學(xué)研究是可行的。miRNA的長(zhǎng)度和高穩(wěn)定性使其具有抗降解能力，可以從長(zhǎng)達(dá)7～10年的FFPE樣品中有效提取，結(jié)果與新鮮冷凍組織相當(dāng)[14-15]。

5 對(duì)策與展望

綜上所述，甲醛固定以不同方式不同程度影響組織的核酸、蛋白質(zhì)和形態(tài)學(xué)的分析。因此，需要有相應(yīng)的對(duì)策來(lái)指導(dǎo)組織標(biāo)本的固定工作：(1)嚴(yán)格按照專家發(fā)布的共識(shí)要求進(jìn)行病理組織標(biāo)本的固定；(2)研發(fā)可以替代甲醛的組織固定液，避免由于甲醛固定引起的影響；(3)應(yīng)用橫波斑點(diǎn)成像等技術(shù)對(duì)甲醛固定過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，量化組織固定的程度，讓組織固定更加規(guī)范化、統(tǒng)一化和標(biāo)準(zhǔn)化；此外，通過(guò)改進(jìn)和優(yōu)化檢測(cè)的方法來(lái)避免甲醛固定引起的影響[16-17]。

在今后的工作中，根據(jù)《免疫組織化學(xué)檢測(cè)技術(shù)共識(shí)》要求[18]，做好FFPE標(biāo)本的固定處理，為下游基因和蛋白分子檢測(cè)打好基礎(chǔ)的同時(shí)，還應(yīng)該大力研發(fā)和推廣組織標(biāo)本的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)技術(shù)。在不久的將來(lái)，精準(zhǔn)組織固定儀器可能會(huì)應(yīng)用到實(shí)際工作中，讓組織標(biāo)本固定更加規(guī)范化和標(biāo)準(zhǔn)化。