匡曉燕，張 藝，申騰飛，蔣雪峰

膠質(zhì)瘤是好發(fā)于成人的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，約占惡性腦腫瘤的81%[1]。血管新生化是膠質(zhì)瘤，尤其是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma, GBM)的突出組織病理學(xué)特征，且與其侵襲性和臨床不良預(yù)后密切相關(guān)[2]。因此，探尋膠質(zhì)瘤中特殊的促血管新生因子，對(duì)于研發(fā)阻斷腫瘤源性血管發(fā)生的精準(zhǔn)治療策略，改善這類血管化腫瘤的臨床療效，顯得尤為重要。本實(shí)驗(yàn)聯(lián)合應(yīng)用免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry, IHC)雙重標(biāo)記和過(guò)碘酸雪夫(periodic acid-Schiff, PAS)特殊染色技術(shù)，發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)生性的一種生長(zhǎng)因子——神經(jīng)膠質(zhì)成熟因子-β(glia maturation factor-β, GMF-β)的表達(dá)與腫瘤血管新生的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 樣本收集2006年1月～2009年12月陸軍軍醫(yī)大學(xué)(原第三軍醫(yī)大學(xué))西南醫(yī)院病理科存檔的50例人GBM標(biāo)本，病理診斷皆根據(jù)WHO(2016)中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)再次明確。

1.2 免疫組化標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋后切片備用。(1)單標(biāo)染色：參照EnVision試劑盒(丹麥Dako公司，K5007)兩步法操作，一抗4 ℃孵育過(guò)夜，二抗37 ℃孵育30 min，之后DAB顯色呈棕黃色。(2)雙標(biāo)染色：應(yīng)用DouSP雙標(biāo)試劑盒(KIT-9999，福州邁新公司)，操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。第一輪標(biāo)記用5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽/氯化硝基四氮唑藍(lán)(BCIP/NBT)顯色呈藍(lán)黑色，第二輪標(biāo)記用3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)顯色呈鮮紅色。如果雙重標(biāo)記后PAS呈紫紅染色，則用DAB棕黃顯色替代AEC的紅色。單標(biāo)和雙標(biāo)染色均設(shè)置同型對(duì)照和磷酸鹽緩沖液空白對(duì)照。

所用一抗包括：兔抗人GMF-β多克隆抗體(NBP1-89755；稀釋比1 ∶200，美國(guó)Novus公司)、兔抗人GFAP多克隆抗體(NB300-141；稀釋比1 ∶1 000，美國(guó)Novus公司)，同型對(duì)照為兔IgG。鼠抗人CD31單克隆抗體(NB600-562；稀釋比1 ∶10，美國(guó)Novus公司)，同型對(duì)照為鼠IgG1κ。GMF-β表達(dá)水平通過(guò)半定量IHC-score評(píng)分法[3]評(píng)估。微血管的判定和計(jì)數(shù)參照Weidner標(biāo)準(zhǔn)[4]，低倍鏡下篩選3個(gè)血管最豐富的腫瘤區(qū)域，高倍鏡下(400×)觀察，凡是孤立存在的CD31陽(yáng)性微血管，包括CD31陽(yáng)性的單個(gè)或成團(tuán)細(xì)胞，皆納入微血管計(jì)算，取3個(gè)視野的平均值即為該樣本的微血管密度(microvessel density, MVD)值。膠質(zhì)瘤細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)而血管內(nèi)皮不表達(dá)的神經(jīng)膠質(zhì)分化標(biāo)志物GFAP，作為瘤細(xì)胞表達(dá)的陽(yáng)性對(duì)照、血管內(nèi)皮表達(dá)的陰性對(duì)照。

1.3 PAS特殊染色采用PAS染色試劑盒(MST-8038，福州邁新公司)，過(guò)碘酸染色10 min，水洗之后，Schiff氏液染色10～20 min，傾去染色液，直接滴加偏重亞硫酸鈉作用1 min(2次)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 6.02軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，選用線性回歸模型分析膠質(zhì)瘤組織中GMF-β表達(dá)與MVD的關(guān)系，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮中GMF-β的表達(dá)(1)IHC單標(biāo)：GMF-β的表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)。單標(biāo)染色檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，不僅腫瘤細(xì)胞中存在GMF-β的表達(dá)，在血管腔面也有GMF-β陽(yáng)性著色(圖1A)。(2)IHC雙標(biāo)：為進(jìn)一步驗(yàn)證GMF-β亦表達(dá)于血管內(nèi)皮，實(shí)驗(yàn)采用雙標(biāo)染色技術(shù)。對(duì)照組GFAP/CD31中，GFAP僅表達(dá)于腫瘤細(xì)胞，不表達(dá)于CD31陽(yáng)性的血管內(nèi)皮中(圖1B)。而實(shí)驗(yàn)組GMF-β/CD31雙標(biāo)染色結(jié)果明確顯示，CD31陽(yáng)性血管內(nèi)皮中也存在GMF-β的表達(dá)，尤其是在具有腫瘤微血管構(gòu)筑表型異質(zhì)性(tumor microvascular architecture phenotype heterogeneity, T-MAPH)的血管叢中，GMF-β強(qiáng)陽(yáng)性更多見(圖1C、D)。另外，還觀察到某些共表達(dá)GMF-β和CD31的散布間變瘤細(xì)胞簇(圖1E)。(3)IHC雙標(biāo)+特殊染色：GMF-β/CD31雙標(biāo)套染PAS的結(jié)果顯示，除了CD31標(biāo)記血管壁上有PAS陽(yáng)性基膜成分，在某些GMF-β陽(yáng)性瘤細(xì)胞構(gòu)成的血管腔樣結(jié)構(gòu)外圍，亦檢測(cè)到PAS陽(yáng)性基膜樣物質(zhì)沉積(圖1F)。

2.2 腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮中GMF-β表達(dá)與MVD的關(guān)系50例GBM中，腫瘤細(xì)胞GMF-β表達(dá)的IHC評(píng)分與MVD之間存在顯著正相關(guān)(r=0.458 8，P<0.001，圖2A)，而血管內(nèi)皮GMF-β表達(dá)的IHC評(píng)分與MVD亦呈正相關(guān)，且相關(guān)性更顯著(r=0.667 6，P<0.000 1，圖2B)。

3 討論

組織形態(tài)學(xué)特征與分子檢測(cè)相結(jié)合的“整合診斷”(integrated diagnosis)，在腫瘤病理學(xué)研究中具有重要意義[5]。與其它分子生物學(xué)技術(shù)相比，IHC技術(shù)具有在組織原位將功能蛋白表達(dá)與組織形態(tài)學(xué)變化有機(jī)結(jié)合的優(yōu)勢(shì)，且便于大樣本分析。與傳統(tǒng)IHC單標(biāo)相比，雙重標(biāo)記可在同一張組織切片上同時(shí)顯示兩種蛋白表達(dá)的相關(guān)性，已應(yīng)用于腫瘤侵襲檢測(cè)、復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)、預(yù)后評(píng)估等多方面的研究領(lǐng)域[6-7]。

ABCDEF

圖1A.GMF-β單標(biāo)：瘤細(xì)胞陽(yáng)性，血管腔面陽(yáng)性著色(箭頭)；B.對(duì)照組雙標(biāo)：瘤細(xì)胞GFAP陽(yáng)性(紅箭頭)，CD31陽(yáng)性血管(黑箭頭)； GMF-β/CD31雙標(biāo)：腎小球樣(C)、樹枝樣(D)血管叢中GMF-β的表達(dá)，瘤細(xì)胞共表達(dá)GMF-β和CD31(E)，紅、黑箭頭分別示GMF-β、CD31陽(yáng)性；F.GMF-β/CD31/PAS三重染色，黃、黑、紅箭頭分別示GMF-β、CD31、PAS陽(yáng)性

圖2 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中GMF-β表達(dá)水平與MVD的相關(guān)性：腫瘤細(xì)胞(A)、血管內(nèi)皮(B)中GMF-β表達(dá)評(píng)分與MVD之間呈正相關(guān)

“BCIP/NBT+AEC”雙標(biāo)顯色體系，應(yīng)用于腫瘤血管新生的組織學(xué)研究，具有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)：(1)先用堿性磷酸酶顯色劑BCIP/NBT呈現(xiàn)的藍(lán)黑色突出顯示血管輪廓，后用辣根過(guò)氧化物酶顯色劑AEC使得血管新生相關(guān)因子呈鮮紅色。(2)兩種著色反差大、對(duì)比鮮明，利于直觀、便捷地觀察候選因子的表達(dá)定位和表達(dá)強(qiáng)弱與腫瘤血管之間的關(guān)系。當(dāng)然，這套顯色體系也有一定的應(yīng)用局限性。其中，過(guò)氧化物酶與底物AEC反應(yīng)形成的紅色沉淀，可溶于有機(jī)溶劑，而且褪色較快，因此需用水性封片劑封片，并及時(shí)觀察、攝像。另外，對(duì)于細(xì)胞核表達(dá)的相關(guān)因子，需應(yīng)用BCIP/NBT顯色時(shí)，后續(xù)應(yīng)注意把控蘇木精輕度復(fù)染，以免BCIP/NBT與蘇木精的著色效果混淆。

近年來(lái)，其它研究組對(duì)IHC也做出了相應(yīng)的改進(jìn)[8-9]。針對(duì)“BCIP/NBT+AEC”顯色體系的局限性，以及套染PAS的技術(shù)需求，作者采取的改進(jìn)措施是，將第二輪標(biāo)記時(shí)與過(guò)氧化物酶反應(yīng)的底物AEC替換為DAB。如此，第二標(biāo)志物呈現(xiàn)DAB的棕黃顯色，與后續(xù)PAS紫紅染色之間的對(duì)比度增大?！癇CIP/NBT+DAB+PAS”三重染色的切片經(jīng)二甲苯透明和中性樹膠封固，可長(zhǎng)期保存切片染色結(jié)果。

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化的組織化學(xué)三重染色技術(shù)，應(yīng)用于膠質(zhì)瘤血管新生的研究。已知GMF-β的主要生理功能是促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)分化，基于神經(jīng)分化和血管生長(zhǎng)之間交互調(diào)控、協(xié)同促進(jìn)的機(jī)制[10]，我們探討GMF-β是否具有促進(jìn)膠質(zhì)瘤源性血管發(fā)生的潛在作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GMF-β在腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮中均表達(dá)，且皆與MVD呈正相關(guān)；GMF-β優(yōu)勢(shì)表達(dá)于具有構(gòu)筑表型異質(zhì)性的腫瘤血管上；某些GMF-β陽(yáng)性瘤細(xì)胞表達(dá)內(nèi)皮特異標(biāo)志物CD31，或者構(gòu)成血管腔樣結(jié)構(gòu)(PAS陽(yáng)性)。上述發(fā)現(xiàn)初步提示，GMF-β參與促進(jìn)膠質(zhì)瘤血管新生，并可能介導(dǎo)GBM細(xì)胞形成血管擬態(tài)(vascular mimicry, VM)樣結(jié)構(gòu)或發(fā)生內(nèi)皮樣分化，為膠質(zhì)瘤細(xì)胞參與構(gòu)成新生血管的理論[11]提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本組的后續(xù)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步驗(yàn)證了GMF-β促進(jìn)膠質(zhì)瘤源性血管形成的作用[12]，該因子有望作為膠質(zhì)瘤的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)以及抗血管治療靶點(diǎn)。總之，發(fā)揮IHC雙重標(biāo)記和特殊染色的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，有利于發(fā)現(xiàn)新的促腫瘤血管生成因子，對(duì)于膠質(zhì)瘤和其它血管化腫瘤的研究，具有特別的應(yīng)用意義。