張 茜，楊月紅，章宏峰

隨著病理技術(shù)的發(fā)展，各種利用超聲震動(dòng)、恒溫水浴和專用試劑對病理組織完成固定、脫水、透明全過程于一體的病理組織處理儀得到廣泛應(yīng)用，是目前國內(nèi)病理科常用的快速制片方法之一[1]。因其方法簡便快捷、省時(shí)省力，很多病理科會用超聲快速石蠟方法對胃腸鏡活檢組織進(jìn)行制片，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在某些活檢組織中，超聲快速石蠟制片可以獲得跟常規(guī)制片一致的HE染色的形態(tài)學(xué)結(jié)果[2]。在后續(xù)沒有手術(shù)大標(biāo)本的情況下，還需要用活檢組織對胃腸道間質(zhì)瘤(gastrointestinal stromal tumour, GIST)的患者進(jìn)行Sanger測序檢測C-Kit和PDGFRA基因突變的情況。本文主要探討經(jīng)超聲快速脫水處理的組織在GIST Sanger測序中對C-Kit和PDGFRA基因突變檢測結(jié)果的影響，以及與常規(guī)脫水組織在GIST Sanger測序中的C-Kit和PDGFRA基因突變檢測結(jié)果的對比分析。

1 材料與方法

1.1 材料收集武漢市中心醫(yī)院病理科2018年3～9月的胃腸道手術(shù)標(biāo)本，每例標(biāo)本常規(guī)取材時(shí)另在腫塊相鄰部位上取大小0.3 cm×0.3 cm×0.2 cm的組織2塊分別進(jìn)行超聲快速脫水和常規(guī)脫水，制成蠟塊后備用。待常規(guī)病理及免疫組化檢測診斷后選取GIST 18例，其中男性8例，女性10例，患者年齡45～83歲，中位年齡66歲。儀器設(shè)備為HT-3型快速組織處理系統(tǒng)(山東駿騰醫(yī)療科技公司)和全自動(dòng)密閉式組織脫水機(jī)(Leica ASP300S)，GIST C-it和PDGFRA基因突變檢測試劑盒購自上海源奇生物公司。

1.2 方法

1.2.1組織處理 將所取每例組織大小0.3 cm×0.3 cm×0.2 cm的2塊組織中的一塊立即放入快速組織處理儀中進(jìn)行超聲快速石蠟制片，超聲快速石蠟制片方法如下：將組織放入第一缸的快速處理液中處理10 min；再將組織浸入第二缸的快速處理液中處理10 min；用濾紙吸取組織表面殘留的處理液，放入預(yù)先融化的石蠟中10 min，等到組織完全下沉不再有氣泡為止。取出組織迅速置于石蠟包埋機(jī)中進(jìn)行石蠟包埋。另一塊行常規(guī)石蠟處理。待常規(guī)病理及免疫組化檢測確診為GIST后，將兩種方法制得的蠟塊同時(shí)進(jìn)行C-Kit和PDGFRA基因檢測。

1.2.2核酸提取 取已制備好的同一患者的常規(guī)石蠟組織和超聲快速石蠟組織蠟塊，每塊切片10張，厚度為3 μm，制成組織切片，取連續(xù)切片的第一張和最后一張切片做常規(guī)HE染色，評估腫瘤細(xì)胞的含量和比例。根據(jù)評估的結(jié)果刮取腫瘤組織細(xì)胞到1.5 mL的EP管中，加入二甲苯1 mL脫蠟，離心去上清后加入無水乙醇，再離心去上清后將組織放置在通風(fēng)處烘干。在EP管中加入180 μL的ATL消化液和20 μL的蛋白酶K，于56 ℃的水浴鍋中消化3 h，90 ℃水浴鍋中孵育1 h，樣本室溫冷卻后，加入200 μL的DNA結(jié)合液和200 μL的無水乙醇，振蕩混勻離心后過吸附柱，經(jīng)2輪洗滌后，加入ATE緩沖液回收富集DNA。

1.2.3核酸定量 用Nanodrop 2000分光光度計(jì)對提取的DNA進(jìn)行測量，確定核酸的濃度和純度。

1.2.4PCR擴(kuò)增 根據(jù)上海源奇生物公司的腫瘤相關(guān)基因突變檢測試劑盒說明書的要求配置PCR MIX混合體系，加22 μL的需要擴(kuò)增的外顯子反應(yīng)液和3 μL的DNA，總反應(yīng)體系為25 μL。擴(kuò)增條件為：42 ℃預(yù)處理5 min，94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性15 s，60 ℃退火25 s，72 ℃延伸1 min，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)后，72 ℃延伸10 min。

1.2.5酶消化 取5 μL的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加2 μL的SAP MIX酶進(jìn)行酶消化，消化程序設(shè)置為37 ℃孵育1 h，85 ℃處理15 min。

1.2.6測序PCR擴(kuò)增 根據(jù)試劑盒說明書配置測序PCR反應(yīng)體系，取3 μL的酶消化產(chǎn)物，加入2 μL的測序引物和1 μL的Bigdye液，總反應(yīng)體系為6 μL。擴(kuò)增條件為：96 ℃預(yù)變性1 min，96 ℃變性10 s，50 ℃退火5 s，60 ℃延伸5 min，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，產(chǎn)物放置在4 ℃冰箱內(nèi)保存。

1.2.7測序PCR產(chǎn)物純化 每個(gè)0.2 mL的EP管中加入3 μL的0.125 mol/L的EDTA，再加入30 μL的無水乙醇，震蕩3次后室溫放置15 min；12 000 r/min離心30 min，棄去上清液；加入70 μL預(yù)冷的70%乙醇，冷凍離心機(jī)4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，棄上清；加入70 μL 預(yù)冷的70%乙醇，冷凍離心機(jī)4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，棄上清；將離心管放置在通風(fēng)處，使乙醇徹底揮發(fā)；加入10 μL的Hi-Di Formamide變性劑，迅速置于95 ℃的水浴鍋中孵育5 min，取出置于冰上。

1.2.8上機(jī)測序 純化后的產(chǎn)物即可在ABI 3500Dx基因分析儀上測序并分析。

2 結(jié)果

2.1 病理質(zhì)控行常規(guī)HE染色，同一患者超聲快速石蠟切片組織結(jié)構(gòu)清晰，染色對比鮮明，與常規(guī)石蠟切片質(zhì)量差異無顯著性，兩種HE切片的形態(tài)學(xué)結(jié)果一致，病理診斷為GIST，鏡下腫瘤細(xì)胞的比約占整張切片的60%(圖1)。

AB

圖1胃腸道間質(zhì)瘤標(biāo)本鏡下所見：A.超聲快速石蠟處理；B.常規(guī)石蠟處理

2.2 核酸的濃度和純度超聲快速石蠟處理的組織和常規(guī)石蠟處理的組織提取核酸濃度和純度均可以滿足下游測序的要求，兩者差異無顯著性(P>0.05，圖2)。

2.3 測序結(jié)果在18例GIST中，超聲石蠟Sanger測序檢測的結(jié)果中，C-Kit 11號外顯子基因突變16例，PDGFRA基因18號外顯子突變2例(表1)。同一患者經(jīng)Leica常規(guī)脫水機(jī)石蠟包埋處理的組織和經(jīng)HT-3型超聲波組織快速處理儀處理的組織樣本在測序片段的大小、背景熒光信號值、正常熒光信號峰和突變熒光信號峰上與常規(guī)石蠟樣本無明顯差異(圖3、4)。18例GIST基因測序結(jié)果完全一致(表1)。

圖2 超聲快速石蠟處理和常規(guī)石蠟處理的胃腸道間質(zhì)瘤標(biāo)本提取的核酸濃度(A)和純度(B)

圖3 胃腸道間質(zhì)瘤標(biāo)本超聲快速石蠟基因檢測：NM_000222.2: c.1679T>A(p.V560D)

圖4 胃腸道間質(zhì)瘤標(biāo)本常規(guī)石蠟基因檢測：NM_000222.2: c.1679T>A(p.V560D)

3 討論

GIST是消化道的一種間葉源性腫瘤，約占全部胃腸道腫瘤的2%[3]。在近20年的研究中，GIST已經(jīng)成為精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)時(shí)代針對特定基因的靶向治療的成功范例，靶向藥物伊馬替尼(Imatinib)對C-Kit基因11號外顯子突變的患者療效最佳[4]。另外，在病理診斷中，對于部分形態(tài)學(xué)符合間質(zhì)瘤梭形細(xì)胞或上皮樣細(xì)胞特點(diǎn)、而免疫組化標(biāo)記CD117和DOG1雙陰性或只有一個(gè)指標(biāo)陽性的病例，若Sanger測序中C-Kit和PDGFRA基因突變陽性，病理醫(yī)師可依據(jù)分子檢測的結(jié)果診斷為GIST[5-6]。因此在胃腸道組織中進(jìn)行Sanger測序檢測C-Kit和PDGFRA基因突變狀況不僅可以預(yù)示患者對靶向藥物的療效，還可以幫助病理醫(yī)師輔助鑒別診斷GIST[6]。

表1 C-Kit(NM_000222.2)和PDGFRA(NM_006206.4)基因突變的檢測結(jié)果

早期的GIST絕大部分病灶較小且患者無臨床癥狀，很多是通過體檢或活檢偶然發(fā)現(xiàn)[3-4]。在病理科對活檢組織進(jìn)行超聲快速石蠟制片廣泛應(yīng)用的今天，有部分的胃腸道活檢組織形態(tài)學(xué)觀察懷疑是GIST但免疫組化標(biāo)記CD117和DOG1雙陰性或只有一個(gè)指標(biāo)陽性時(shí)，可以直接使用超聲快速石蠟制片的活檢標(biāo)本進(jìn)行C-Kit和PDGFRA基因突變的檢測以輔助診斷GIST。臨床需要考慮使用Imatinib治療時(shí)，需要先明確C-Kit和PDGFRA基因的突變狀態(tài)，這種情況下也可以選用超聲快速石蠟處理的標(biāo)本。

常規(guī)石蠟組織是新鮮標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林固定6～24 h，再經(jīng)過由低至高各級濃度的乙醇逐級脫水，二甲苯透明以及浸蠟等程序制成，該流程耗時(shí)10～20 h。目前HE和分子病理的診斷標(biāo)準(zhǔn)均是根據(jù)組織經(jīng)常規(guī)石蠟包埋制片而制定的。超聲快速石蠟是病理技術(shù)中的特殊領(lǐng)域，應(yīng)用環(huán)保型生物組織處理試劑結(jié)合HT-3處理儀處理病理組織是利用超聲原理，在處理液中快速振蕩病理組織和有機(jī)溶劑，實(shí)現(xiàn)周期性縮張的效果，進(jìn)而提高分子運(yùn)動(dòng)的速率，加速液體交換，使得細(xì)胞滲透性、溶劑分子穿透力顯著增強(qiáng)，最終實(shí)現(xiàn)病理組織的快速處理和診斷。該方法操作簡便、安全可靠、省時(shí)省力，僅需30 min左右，3個(gè)步驟就可完成脫水、透明和浸蠟的全部流程，與常規(guī)石蠟制片相比雖然可以大大縮短制片時(shí)間[1-2]。但由于在脫水過程中超聲快速石蠟組織未經(jīng)10%中性福爾馬林充分固定，用了環(huán)保型生物組織處理試劑結(jié)合超聲波的作用處理組織。在分子檢測中其核酸質(zhì)量和基因檢測結(jié)果與常規(guī)脫水組織是否一致，目前還尚無大量文獻(xiàn)報(bào)道。

在超聲快速石蠟組織脫水過程中所用環(huán)保型生物組織處理試劑大多是醇性試劑，能有效保存核酸成分，而且Sanger測序檢測方法對核酸的質(zhì)量和濃度的要求比較高，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)超聲快速石蠟組織脫水過程中超聲波和生物組織處理試劑對核酸的質(zhì)量和濃度無影響，且不影響下游的C-Kit和PDGFRA基因突變檢測的結(jié)果。在臨床只有超聲快速石蠟標(biāo)本的情況下，可以用超聲快速石蠟組織行GIST的C-Kit和PDGFRA基因突變檢測，以便輔助診斷和預(yù)示靶向治療效果。需要注意的是超聲快速脫水的組織取材大小不能過厚，以免組織脫水不徹底影響制片質(zhì)量和蠟塊的保存，另外在提取核酸時(shí)盡量選擇已通過CFDA認(rèn)證的商品化的核酸提取試劑盒。