顧冬梅，覃玲艷，干文娟，虞 杰，尤志群，郭凌川，王修珍

結(jié)直腸癌是人類最常見的惡性腫瘤之一[1]。目前結(jié)直腸癌占全球癌癥發(fā)病率的第4位，病死率的第2位[2]。相關(guān)研究[3]表明結(jié)直腸癌發(fā)生與Wnt信號通路的異常調(diào)節(jié)有關(guān)。結(jié)腸腺瘤性息肉病蛋白(adenomatous polyposis coli, APC)是Wnt信號通路的成員之一，其突變與結(jié)直腸癌的發(fā)生密切相關(guān)[4]。β-catenin即β-連接蛋白，是Wnt信號通路的關(guān)鍵分子，其在結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。COX-2是一種可誘導(dǎo)的前列腺素合成酶(prostaglandin G/H synthase, PTGS)，是Wnt信號通路的下游靶基因[5]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用組織芯片聯(lián)合全自動免疫組化EnVision兩步法檢測Wnt信號通路成員APC、β-catenin和COX-2在結(jié)直腸癌組織和癌旁正常結(jié)直腸組織中的表達(dá)，分析三者表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系，探討其在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料收集蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院2011年1月～2015年12月存檔的112例結(jié)直腸癌手術(shù)切除標(biāo)本，其中結(jié)腸癌59例，直腸癌53例；男性59例，女性53例；患者年齡31～91歲，平均61.86歲；腫瘤直徑≤5 cm者81例，>5 cm者31例；依據(jù)WHO(2010)消化系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)[6]對各病例進(jìn)行分類：高分化2例，中分化97例，低分化13例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移66例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移46例，伴遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移10例；未侵及漿膜層36例、侵及漿膜層76例；Ⅰ+Ⅱ期44例，Ⅲ+Ⅳ期68例。患者術(shù)前均未進(jìn)行放、化療等治療。另選取對應(yīng)的距離癌組織2 cm的癌旁正常結(jié)直腸組織作為對照。所有組織均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水浸蠟，石蠟包埋。

1.2 方法選取所需病例組織蠟塊，制作組織芯片陣列(圖1)，3 μm厚連續(xù)切片，采用免疫組化EnVision兩步法染色。具體操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行，用PBS替代一抗做陰性對照。兔抗人APC多克隆抗體，兔抗人COX-2單克隆抗體，均購自北京中杉金橋公司；鼠抗人β-catenin單克隆抗體購自上?；蚬?；免疫組化EnVision試劑盒及其他試劑均購自美國羅氏公司。

AB

圖1結(jié)直腸癌組織(A)和正常結(jié)直腸組織(B)的組織芯片蠟塊

1.3 判讀標(biāo)準(zhǔn)APC和COX-2陽性定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜，呈棕黃色顆粒狀。按陽性細(xì)胞百分比評分：≤4%為0分，5%～24%為1分，25%～49%為2分，50%～74%為3分，75%～100%為4分。按細(xì)胞染色強(qiáng)度評分：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘：0分為(-)，1～2分為(+)，3～4分為()，5分以上為()，其中≥3分為陽性[7]。β-catenin陽性呈棕黃色細(xì)小顆粒狀，以細(xì)胞膜染色陽性且陽性細(xì)胞數(shù)≥70%為正常表達(dá)，細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞核染色陽性且細(xì)胞數(shù)≥10%為異位表達(dá)。出現(xiàn)細(xì)胞膜表達(dá)減弱或缺失以及異位表達(dá)均視為異常表達(dá)[8]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。表達(dá)的差異性采用χ2檢驗(yàn)、校正χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性采用Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)；以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組織和正常結(jié)直腸組織中APC、β-catenin和COX-2的表達(dá)APC在結(jié)直腸癌組織和癌旁正常結(jié)直腸組織中的陽性率分別為40.2%(45/112)、93.8%(105/112)(圖2)。β-catenin在正常結(jié)直腸組織中的表達(dá)主要定位于細(xì)胞膜，在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞核。β-catenin在結(jié)直腸癌組織和癌旁正常結(jié)直腸組織中的陽性率分別為72.3%(81/112)、10.7%(12/112)(圖3、4)；COX-2在結(jié)直腸癌組織和癌旁正常結(jié)直腸組織中的陽性率分別76.8%(86/112)、11.6%(13/112)(圖5)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表1)。

②③④⑤

圖2APC在正常結(jié)直腸組織中呈細(xì)胞質(zhì)陽性，EnVision兩步法

圖3β-catenin在結(jié)直腸癌組織中的異位表達(dá)，呈細(xì)胞質(zhì)陽性，EnVision兩步法圖4β-catenin在結(jié)直腸癌組織中的異位表達(dá)，呈細(xì)胞核陽性，EnVision兩步法圖5COX-2在結(jié)直腸癌組織中呈細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜陽性，EnVision兩步法

2.2 結(jié)直腸癌中APC、β-catenin和COX-2表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系A(chǔ)PC蛋白表達(dá)與腫瘤分化程度相關(guān)(P<0.05)；與患者年齡、性別、腫瘤大小、位置、腫瘤的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期均無關(guān)(P>0.05，表2)。β-catenin和COX-2蛋白表達(dá)與腫瘤的分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期相關(guān)(P<0.05)；與患者性別、年齡、腫瘤大小、位置均無關(guān)(P>0.05，表2)。

2.3 結(jié)直腸癌組織中APC、β-catenin和COX-2表達(dá)的相關(guān)性在結(jié)直腸癌組織中，APC表達(dá)與β-catenin的異常表達(dá)、COX-2的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.551，P<0.01；rs=-0.542，P<0.01)；β-catenin的異常表達(dá)與COX-2的表達(dá)呈正相關(guān)(rs=0.558，P<0.01，表3)。

3 討論

結(jié)直腸癌是嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤，其發(fā)病率逐年呈遞增趨勢，預(yù)計(jì)2030年全球發(fā)展中國家結(jié)直腸癌的發(fā)病率高達(dá)60%[9]。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是受多因素影響的復(fù)雜過程，Wnt信號通路上一些關(guān)鍵因子的調(diào)控與結(jié)直腸癌的發(fā)生密切相關(guān)。

APC是一種親水性胞質(zhì)蛋白，定位于結(jié)直腸黏膜上皮細(xì)胞的基膜。臨床研究發(fā)現(xiàn)，約70%的結(jié)直腸癌存在APC基因缺失或突變[10]。正常的APC蛋白與Axin和β-catenin相結(jié)合，并通過GSK-3β促進(jìn)β-catenin磷酸化[11]，激活Wnt信號通路，促進(jìn)細(xì)胞大量增殖、分化，誘發(fā)癌變。本組實(shí)驗(yàn)中APC在結(jié)直腸癌組織中的陽性率為40.2%(45/112)低于正常結(jié)直腸組織(93.8%，105/112)，且APC蛋白在結(jié)直腸癌高+中分化組中的表達(dá)顯著高于低分化組(P<0.05)，這與Nelson等[12]對APC蛋白功能的研究結(jié)果一致，提示APC蛋白失表達(dá)在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。

β-catenin蛋白主要定位于細(xì)胞膜。在細(xì)胞癌變過程中，游離的β-catenin積聚于細(xì)胞質(zhì)，并隨濃度上升進(jìn)入細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，促進(jìn)下游靶基因的激活與異常轉(zhuǎn)錄[13]。在本組癌旁正常結(jié)直腸組織中，β-catenin主要表達(dá)于細(xì)胞膜，在結(jié)直腸癌中，β-catenin主要異常表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞核。β-catenin在結(jié)直腸癌組織中的異常表達(dá)率為72.3%(81/112)，遠(yuǎn)高于正常結(jié)直腸組織。提示β-catenin在腫瘤細(xì)胞中有按胞膜→胞質(zhì)→胞核方向流動的趨勢，這與Peker等[14]的研究結(jié)果相符。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在結(jié)直腸癌組織中，β-catenin的表達(dá)與腫瘤分化程度呈負(fù)相關(guān)，與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期呈正相關(guān)(P<0.05)，提示β-catenin的異常表達(dá)對結(jié)直腸癌的分化、侵襲及轉(zhuǎn)移有重要影響。

表1 結(jié)直腸癌組織和癌旁正常結(jié)直腸組織中APC、β-catenin和COX-2的表達(dá)

表2 結(jié)直腸癌中APC、β-catenin和COX-2的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

表3 結(jié)直腸癌組織中APC、β-catenin和COX-2表達(dá)的相關(guān)性

COX-2即誘導(dǎo)型環(huán)氧化酶，在機(jī)體受各種炎癥介質(zhì)、激素及促瘤因素等的刺激作用下高表達(dá)[15]，是Wnt通路的靶基因。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，COX-2在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)(76.8%，86/112)與Mahmoud等[16]的研究結(jié)果一致。相關(guān)研究表明，COX-2過表達(dá)可抑制E-cadherin的功能，使腫瘤細(xì)胞黏附性降低，促使腫瘤局部浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在結(jié)直腸癌組織中，COX-2表達(dá)與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)(P<0.05)。提示COX-2有可能成為判斷結(jié)直腸癌生物學(xué)行為及評估預(yù)后的重要標(biāo)志物。

在Wnt信號通路中，APC的突變或缺失可導(dǎo)致β-catenin大量聚集進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與TCF/LEF1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，激活下游靶基因。COX-2含有TCF結(jié)合位點(diǎn)，是β-catenin通路的下游靶基因，β-catenin的異常表達(dá)可上調(diào)COX-2的表達(dá)[5]。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在結(jié)直腸癌組織中APC的表達(dá)與β-catenin的異常表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.551)，β-catenin的異常表達(dá)與COX-2的表達(dá)呈正相關(guān)(rs=0.558)，提示APC蛋白失活是β-catenin異常表達(dá)的誘因，β-catenin異常聚集可通過增加COX-2的過表達(dá)促進(jìn)腫瘤的演變。由此認(rèn)為APC突變→引起β-catenin積聚→β-catenin與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF1結(jié)合→激活COX-2→致癌，因此APC功能缺失導(dǎo)致COX-2轉(zhuǎn)錄作用失控，從而誘發(fā)癌變。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用組織芯片聯(lián)合全自動免疫組化EnVision兩步法檢測APC、β-catenin和COX-2在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系，表明三者通過Wnt信號通路共同參與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展過程，促進(jìn)腫瘤的演變。因此單獨(dú)或聯(lián)合檢測APC、β-catenin和COX-2的表達(dá)，有助于提高結(jié)直腸癌的臨床診斷、評估預(yù)后和研發(fā)抗腫瘤藥物的新靶點(diǎn)。