宋鵬濤，劉順林，劉志聰，平金良

肺癌是全球范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤，因缺乏有效的診斷標(biāo)志物造成其早期診斷率低，一旦發(fā)現(xiàn)多數(shù)已處于晚期，導(dǎo)致其治療效果差，預(yù)后不良，病死率極高，5年生存率僅為15%左右。因此，尋找敏感、高效和特異性強的早期診斷標(biāo)志物成為迫在眉睫的任務(wù)，這在肺癌的防治中起著至關(guān)重要的作用。

Copines蛋白家族是新近發(fā)現(xiàn)的一類分布廣泛、進化保守的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白[1]。最近研究表明，CPNE家族成員與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[2]。Copine1(CPNE1)是Copines家族中第一個被發(fā)現(xiàn)的成員，其定位于人第20號染色體上，編碼537個氨基酸[3]。但目前對該基因的研究報道非常少，而在腫瘤方面的研究更鮮有報道。本課題組前期實驗發(fā)現(xiàn)，CPNE1蛋白在肺腺癌組織中的表達強度明顯高于正常肺組織，本實驗應(yīng)用免疫組化SP法和RT-PCR技術(shù)檢測CPNE1在肺腺癌組織和正常肺組織中的表達及其與肺癌臨床病理特征的關(guān)系，為肺癌的早期診斷和臨床預(yù)后評估奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料收集2007～2012年浙江省湖州市中心醫(yī)院病理科診斷的人肺腺癌標(biāo)本186例，所有肺腺癌患者術(shù)前均未行放、化療等其他治療。其中男性96例，女性90例，年齡20～79歲，平均59歲；正常肺組織30例，其中男性20例，女性10例，年齡45～73歲，平均60歲，所有組織標(biāo)本均經(jīng)兩位病理科醫(yī)師證實。所有標(biāo)本均按照2009年國際抗癌聯(lián)盟(AJCC)TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進行臨床分期，其中Ⅰ+Ⅱ期101例，Ⅲ+Ⅳ期85例；分化程度：低分化94例，高+中分化92例。

1.2 方法

1.2.1免疫組化 采用免疫組化SP法檢測CPNE1的表達。石蠟包埋組織4 μm厚切片，常規(guī)脫蠟，梯度乙醇(95%、85%、75%)水化，抗原修復(fù)液(0.01 mol/L枸櫞酸鈉緩沖液，pH 6.0)修復(fù)2次，PBS洗滌3次，一抗4 ℃過夜(1 ∶2 000兔抗人CPNE1)，其中陰性對照所用的一抗則用正常的羊血清，過夜后PBS洗滌，加入二抗，37 ℃，孵育時間30 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封固等步驟后進行觀察[4]，操作步驟嚴(yán)格按檢測試劑盒說明書進行。

結(jié)果判定與分析：CPNE1蛋白在肺腺癌組織及正常肺組織中免疫組化結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)參考Yu等[5]的方法，光鏡下觀察整個組織標(biāo)本的著色范圍與著色強度。CPNE1蛋白陽性定位于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜，呈棕黃色或棕褐色顆粒。在高倍鏡下(×400)，以5個不同的視野為隨機采取對象，計算陽性細(xì)胞總數(shù)，按陽性細(xì)胞數(shù)所占的百分比(P)計算分值：陽性細(xì)胞數(shù)<10%為1分，10%～50%為2分，50%～75%為3分，>75%為4分；按照細(xì)胞染色強度計分：陰性為1分，弱陽性為2分，中等強度為3分，強陽性為4分。將兩項得分結(jié)果相乘：4分以下為(-)；4～8分為(+)；8～12分為()；12～16分為()。(～)級為高表達，屬于高表達組，(-～+)為低表達，屬于低表達組。同時根據(jù)肺腺癌患者性別、年齡、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征將186例患者進行分組，比較CPNE1蛋白表達水平在各組間存在的差異性。

1.2.2RT-PCR 采用TRIzol試劑盒從肺腺癌組織中提取總RNA進而利用Super Script Ⅲ逆轉(zhuǎn)錄酶(美國Invitrogen公司)將總RNA樣品用隨機引物逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。設(shè)計合成引物進行RT-PCR。引物序列如下：上游5′-ACCCACTCTGCGTCCTT-3′，下游5′-TGGCGTCTTGTTGTCTATG-3′，并以ACTB mRNA作為內(nèi)參，其引物序列如下：上游5′-CACAGAGC CTCGCCTTTGCC-3′，下游5′-ACCCATGCCCACCAT CACG-3′。所有反應(yīng)進行3個重復(fù)，表達水平通過2-ΔΔCt法分析。

1.2.3Western blot法 分別提取20例肺癌組織和正常肺組織的總蛋白，利用SDS-PAGE變性凝膠電泳等技術(shù)進行蛋白分離，經(jīng)電轉(zhuǎn)、脫脂、封閉、洗滌等步驟，再加入一抗和二抗后，進行光密度積分值分析，進而計算不同組織中的蛋白相對含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析利用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗法進行分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺癌組織和正常肺組織中CPNE1蛋白的表達CPNE1蛋白主要位于人肺腺癌細(xì)胞質(zhì)，同時其在細(xì)胞膜中也少量存在，主要呈棕褐色(圖1)。在186例肺腺癌組織中有68例呈低表達(36.56%)，118例呈高表達(63.44%)，在30例肺正常組織中均呈低表達。

CPNE1蛋白表達在無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組中的高表達率為58.12%，有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組的高表達率為80.76%；CPNE1蛋白表達在Ⅰ+Ⅱ分期中的高表達率為41.58%，在Ⅲ+Ⅳ分期中的高表達率為84.71%。CPNE1表達與肺腺癌TNM分期(P<0.05)、臨床分期(P<0.05)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(P<0.05)相關(guān)。CPNE1與肺腺癌分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，與患者年齡、性別、腫瘤大小等無關(guān)(表1)。

表1 肺腺癌中CPNE1的表達與臨床病理特征的相關(guān)性[n(%)]

ABC

圖1CPNE1在肺腺癌組織和正常肺組織中的表達：A.在肺腺癌組織中低表達；B.在肺腺癌組織中高表達；C.在正常肺組織中低表達，SP法

2.2 正常肺組織和肺腺癌組織中CPNE1基因表達分析對正常肺組織和肺腺癌組織中CPNE1 mRNA表達量進行檢測，結(jié)果顯示20例肺腺癌組織中CPNE1 mRNA表達量均顯著高于正常肺組織。該結(jié)果與免疫組化結(jié)果基本一致，也從另外一個角度驗證了肺腺癌組織中CPNE1的表達量高于正常肺組織(圖2)。

圖2 正常肺組織和肺腺癌組織中CPNE1基因的表達

2.3 正常肺組織和肺腺癌組織中CPNE1蛋白的差異Western blot結(jié)果顯示，20例肺腺癌組織中CPNE1蛋白含量均顯著高于正常肺組織(圖3)。該結(jié)果與免疫組化及RT-PCR結(jié)果基本一致，也從另外一個角度驗證了肺腺癌組織中CPNE1蛋白的表達量高于正常肺組織。

圖3 Western blot法檢測肺腺癌組織和正常肺組織中CPNE1蛋白的表達

3 討論

腫瘤蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重點內(nèi)容之一是篩選腫瘤與正常組織細(xì)胞之間的差異表達蛋白質(zhì)組，并探尋差異蛋白質(zhì)的功能[6]。正常組織細(xì)胞與腫瘤組織細(xì)胞間的差異蛋白表達存在明顯差異并會隨著腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程的變化而變化，這些差異性變化也反應(yīng)在腫瘤發(fā)生惡性特征、功能轉(zhuǎn)換、細(xì)胞凋亡分化等生物學(xué)過程[7-9]，這對于認(rèn)識腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和癌變機制，篩選尋找高度特異性、敏感性的腫瘤診斷標(biāo)志物以及新的藥物作用靶點提供理論依據(jù)，對腫瘤的早期診斷、預(yù)防和治療具有重要的現(xiàn)實意義。本實驗采用免疫組化SP法和RT-PCR法從兩個角度驗證了CPNE1蛋白在肺腺癌組織和正常肺組織間的差異表達，結(jié)果表明肺腺癌組織CPNE1的表達量顯著高于正常肺組織，CPNE1蛋白表達與肺腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期有關(guān)。CPNE1蛋白表達與肺腺癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)，有望成為肺腺癌預(yù)后評估的重要指標(biāo)。

CPNE1蛋白是Copines家族中最早發(fā)現(xiàn)的成員，是由Creutz在研究分離草履蟲偶聯(lián)蛋白時首先發(fā)現(xiàn)的[10]。近年眾多研究表明，CPNE家族成員與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、膜轉(zhuǎn)運及胞內(nèi)信號傳導(dǎo)等相關(guān)。Kulesza等[11]發(fā)現(xiàn)CPNE3在非小細(xì)胞肺癌中是一種新型的腫瘤轉(zhuǎn)移促進因子，而其在乳腺腫瘤、前列腺腫瘤和卵巢腫瘤中差異蛋白質(zhì)組學(xué)的結(jié)果也表明其表達量顯著高于正常組織，表明其與上述癌癥存在一定的關(guān)系。Maitra等[12]發(fā)現(xiàn)Copine-4與前列腺的調(diào)節(jié)和形成具有一定的相關(guān)性。Bruin等[13]在研究散發(fā)性乳腺癌雜合性缺失(loss of heterozygosity, LOH)時發(fā)現(xiàn)CPNE7存在于LOH中，表明CPNE7可能具有抑癌基因的作用。CPNE8是一種較晚發(fā)現(xiàn)的Copine家族成員，最近研究表明其在前列腺、心臟及腦組織中的表達較為常見[15]，同時，Ramsey等[14]發(fā)現(xiàn)其可能是急性髓性白血病癌細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控因子。

雖然CPNE1是最早發(fā)現(xiàn)的Copines家族成員，但對其研究相對較少，而其在腫瘤方面的研究幾乎為空白。Yang等[15]在研究人類CPNE1時發(fā)現(xiàn)其定位于第20號染色體，編碼537個氨基酸，有多種剪切方式。Ghislat等[16]研究發(fā)現(xiàn)CPNE1是一種Ca2+依賴結(jié)合蛋白，其在自噬體和溶酶體以及內(nèi)涵體的膜融合過程中起重要的調(diào)節(jié)作用。Ma等[17]在研究丹酚酸對心腦血管治療作用時發(fā)現(xiàn)，CPNE1可能是細(xì)胞骨架蛋白的重要成分，且在信號傳導(dǎo)途徑中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，本實驗從不同角度驗證了CPNE1蛋白在肺腺癌組織和正常肺組織間的差異表達，并表明其與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期有關(guān)，CPNE1蛋白表達與肺腺癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)，有望成為肺腺癌預(yù)后評估的重要指標(biāo)，但其具體機制仍需進一步深入探究。