夏 丹，孟 琴

細(xì)胞自噬是細(xì)胞依賴溶酶體對自身胞質(zhì)組分進(jìn)行降解的重要途徑，不僅對細(xì)胞應(yīng)激、病原體清除至關(guān)重要，也參與生物個體的生長、發(fā)育和衰老過程[1]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是一個有效的自噬誘導(dǎo)因素[2]。但對聯(lián)系這兩個不同細(xì)胞內(nèi)通路間的信號或分子尚缺乏了解。近年研究發(fā)現(xiàn)，自噬水平變化引起的細(xì)胞功能改變是腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的重要環(huán)節(jié)，與結(jié)腸癌的發(fā)病密切相關(guān)[3-4]。MARCH2(the membrane associated RING-CH 2)是跨膜RING-CH finger蛋白，具有多種生物學(xué)功能，如免疫調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)控和膜運(yùn)輸。鑒于MARCH2主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，本文著重探討MARCH2是否通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)控自噬，為潛在的臨床結(jié)腸腫瘤應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料MARCH2、IRE1α和PERK抗體購自美國Abcam公司；LC3B和BafilomycinA1購自Sigma Aldrich公司；ATG5、CHOP、EIF2α、ATF4和p-EIF2α抗體購自美國CST公司；GRP78抗體購自Bioss公司；p-PERK和ATF6α(F-7)抗體購自Santa Cruz公司；XBP1s抗體購自Biolegend公司；ATF6抗體購自Imagnex公司；TRIB3抗體購自Novus Biologicals公司。

1.2 RNA干擾MARCH2 shRNA：5′-GATCCGTG GCTTTCCTCATCTAACTTCAAGAGAGTTAGATGAGG AAAGCCACTTTTTTGGAAA-3′和5′-AGCTTTTCCAA AAAAGTGGCTTTCCTCATCTAACTCTCTTGAAGTTAG ATGAGGAAAGCCACG-3′；ATF4 siRNA：5′-TCCCT CAGTGCATAAAGGA-3′；CHOP siRNA：5′-GCCTGG TATGAGGACCTGC-3′；TriB3 siRNA：5′-GCUCU CAGCUCCUAUACACTT-3′。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，常規(guī)傳代。shRNA及其轉(zhuǎn)染用Lipofectamine 2000，具體操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 構(gòu)建沉默MARCH2穩(wěn)定的細(xì)胞系將shMARCH2或shControl轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞，經(jīng)過嘌呤霉素(10 μg/mL)篩選得到沉默MARCH2的穩(wěn)定細(xì)胞系。

1.5 RT-PCR收獲不同細(xì)胞，提取總RNA，用Reverse Transcript Kit(Invitrogen公司)逆轉(zhuǎn)錄合成單鏈cDNA文庫。PCR使用的引物詳見表1。

表1 RT-PCR引物

1.6 Western blot法HCT116細(xì)胞總蛋白的提取，蛋白定量，5%牛奶(TBST液配制)室溫封閉1 h；加入相應(yīng)的一抗，4 ℃過夜；然后加入相應(yīng)的DyLight 680/800標(biāo)記的二抗(1 ∶10 000)，室溫避光反應(yīng)1 h；用Odyssey Infrared Imager檢測熒光信號并分析灰度值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，組間比較采用Studentt檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 沉默MARCH2對結(jié)腸癌細(xì)胞自噬水平的影響本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建MARCH2 shRNA，將shMARCH2或shControl轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞，經(jīng)過嘌呤霉素以適合的濃度篩選得到沉默MARCH2的穩(wěn)定細(xì)胞系，并對其有效性進(jìn)行mRNA及Western blot水平鑒定(圖1)，結(jié)果顯示MARCH2 shRNA能有效敲減細(xì)胞中MARCH2 mRNA及蛋白水平，證實(shí)合成的shMARCH2有效。

與對照組相比，敲減MARCH2能升高內(nèi)源性LC3B-Ⅱ的水平(圖2)。增高的LC3B-Ⅱ可能源于自噬體生成的增多或降解的減少，為了區(qū)分這兩種可能性，實(shí)驗(yàn)使用了自噬體晚期抑制劑巴弗洛霉素A1(BafA1，抑制囊泡H+-ATPase，溶酶體酸化受抑，從而阻礙自噬體與溶酶體的融合)。結(jié)果顯示，經(jīng)BafA1處理(孵育6 h)阻斷溶酶體降解后，與對照組相比，MARCH2沉默細(xì)胞中內(nèi)源性LC3B-Ⅱ的水平進(jìn)一步升高(圖2)，表明MARCH2沉默促進(jìn)了自噬體的生成，而非阻斷其降解。結(jié)果表明MARCH2表達(dá)沉默在本底水平能促進(jìn)自噬。

圖1 MARCH2 shRNA的鑒定：1.shControl；2.shMARCH2

圖2 Western blot法檢測LC3B-Ⅱ的水平變化*P<0.05，**P<0.01

2.2 沉默MARCH2對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路的影響鑒于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是調(diào)控自噬通路之一，且MARCH2主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。本組實(shí)驗(yàn)分別檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK、ATF6和IRE1α信號通路，Western blot法結(jié)果顯示，在沉默MARCH2的HCT116細(xì)胞中，包括p-PERK、p-eIF2α和ATF4等UPR分子表達(dá)水平升高，同時伴隨著ATG12-ATG5結(jié)合物的增多(圖3A)。此外，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)切割的ATF6、p-IRE1α和XBP1s在沉默MARCH2的HCT116細(xì)胞中表達(dá)水平也有輕度上調(diào)。與這些結(jié)果相一致的是，ER應(yīng)激傳感蛋白GRP78在沉默MARCH2的HCT116細(xì)胞中也有升高(圖3B)，提示沉默MARCH2引起的PERK、ATF6和IRE1α通路的活化可能促進(jìn)MARCH2介導(dǎo)的自噬。

圖3 沉默MARCH2對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的作用：A.p-PERK、p-eIF2α和ATF4等表達(dá)水平升高；B.ATF6、p-IRE1α和XBP1s等表達(dá)水平輕度上調(diào)

2.3 MARCH2通過ATF4-CHOP-TRIB3-AKT-MTOR軸調(diào)控自噬首先檢測沉默MARCH2對AKT-MTOR信號通路及TRIB3水平的影響；然后敲減CHOP，檢測TRIB3水平；敲減TRIB3，檢測AKT-MTOR信號通路；敲減ATF4，檢測TRIB3、CHOP、ATG12-ATG5、AKT-MTOR信號通路，明確MARCH2是否通過ATF4-CHOP-TRIB3-AKT-MTOR軸調(diào)控自噬。結(jié)果顯示，沉默MARCH2的結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞中AKT-MTOR信號減弱，TRIB3、CHOP和ATG12-ATG5結(jié)合物蛋白水平升高(圖4)，提示沉默MARCH2可能通過上調(diào)CHOP，從而升高TRIB3，導(dǎo)致AKT-MTOR抑制，最終促進(jìn)自噬發(fā)生。

為進(jìn)一步確認(rèn)，應(yīng)用siRNA敲減CHOP，發(fā)現(xiàn)沉默CHOP會引起TRIB3的蛋白水平降低(圖5)。接著敲減了TRIB3，發(fā)現(xiàn)AKT-MTOR信號有所回升(圖6)。最后敲減ATF4，發(fā)現(xiàn)CHOP和TRIB3蛋白水平降低，AKT-MTOR信號回升，ATG12-ATG5結(jié)合物水平降低(圖7)。上述結(jié)果表明，ATF4-CHOP-TRIB3-AKT-MTOR軸在沉默MARCH2誘導(dǎo)自噬發(fā)生過程中起到非常重要的作用。

3 討論

MARCH家族是一個結(jié)構(gòu)上相關(guān)聯(lián)的蛋白家族，其成員結(jié)構(gòu)特點(diǎn)為由N端的RING-CH結(jié)構(gòu)域和緊連的C端兩個或多個跨膜區(qū)組成。這種跨膜RING-CH指蛋白具有多種生物學(xué)功能，如免疫調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)控和膜運(yùn)輸?shù)取Ｄ壳癕ARCH家族有11個成員(MARCH-I-XI)。其中MARCH-I可介導(dǎo)MHC-Ⅱ泛素化，是胸腺中T細(xì)胞發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因子。MARCH-X和MARCH-XI參與精子的形成和發(fā)育。MARCH-Ⅱ基因是Bartee課題組[5]于2004年發(fā)現(xiàn)，MARCH-Ⅱ能降解細(xì)胞表面受體如轉(zhuǎn)鐵蛋白受體和共刺激分子B7.2(CD86)。應(yīng)用免疫熒光觀察到MARCH蛋白與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及溶酶體共定位[5]。鑒于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是調(diào)控自噬通路之一[6-7]，且MARCH2主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)[5]，沉默MARCH2是否通過引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激從而觸發(fā)自噬過程？內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上存在PERK、ATF6和IRE1α三個內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)感受分子[8-9]。PERK/eIF2a途徑是UPR信號通路之一，不發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時，PERK與GRP78/Bip以未活化的形式結(jié)合，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時，PERK與GRP78分離而活化，從而磷酸化其下游的eIF2α，導(dǎo)致eIF2α失活，終止細(xì)胞內(nèi)絕大多數(shù)蛋白的合成，并調(diào)節(jié)下游細(xì)胞周期。PERK/eIF2a通路也激活A(yù)TF4，引起CHOP表達(dá)。活化的IRE1α可作為RNase激發(fā)XBP1 mRNA轉(zhuǎn)錄，成為UPR靶基因(如GRP78/BiP和鈣網(wǎng)蛋白)的轉(zhuǎn)錄激活因子。持久的UPR會活化PERK，進(jìn)而磷酸化eIF2α，抑制細(xì)胞內(nèi)mRNA轉(zhuǎn)錄。有研究表明，IRE1α和PERK可以激活細(xì)胞保護(hù)性胞內(nèi)降解系統(tǒng)——自噬，做為替代途徑降解細(xì)胞內(nèi)積累的錯誤折疊蛋白。同時，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過程中，ATF6從Bip上解離可以從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)位到高爾基體，裂解的ATF6轉(zhuǎn)移到核激活不同的分子伴侶和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物如CHOP[7-9]。

圖4 Western blot法檢測AKT-MTOR信號通路及TRIB3蛋白水平：1.shControl；2.shMARCH2

圖5 沉默CHOP對TRIB3蛋白表達(dá)水平的影響

圖6 敲減TRIB3對AKT-MTOR信號的影響

圖7 Western blot法檢測ATF4、CHOP、TRIB3、AKT-MTOR信號通路蛋白及ATG12-ATG5結(jié)合物水平的變化

TRIB3是新的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)基因，TRIB3的表達(dá)升高可以由CHOP誘導(dǎo)，并觸發(fā)磷酸化AKT的抑制[10]。

本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，沉默MARCH2的結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞中AKT-MTOR信號減弱，而TRIB3、CHOP和ATG12-ATG5結(jié)合物蛋白水平升高。沉默CHOP會引起TRIB3的蛋白水平降低；敲減TRIB3引起AKT-MTOR信號有所回升；敲減ATF4導(dǎo)致CHOP和TRIB3蛋白水平降低，AKT-MTOR信號回升，ATG12-ATG5結(jié)合物水平降低。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，沉默MARCH2可能通過上調(diào)CHOP，從而升高TRIB3，導(dǎo)致AKT-MTOR抑制，最終促進(jìn)自噬發(fā)生。ATF4-CHOP-TRIB3-AKT-MTOR軸在沉默MARCH2誘導(dǎo)自噬發(fā)生過程中具有重要作用。