居紅格，李 峰，馬俊兵，張文連，賀 帥，張 偉

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，嚴重危害女性生命健康。乳腺癌是一組高異質(zhì)性的腫瘤，不同分子亞型其臨床病理特點、治療方法及預后各不相同。其中三陰型乳腺癌(triple negative breast cancer, TNBC)約占所有乳腺癌總數(shù)的13%[1]。與其它分子亞型相比，TNBC侵襲性強、易轉(zhuǎn)移、預后較差。本實驗采用免疫組化、酶聯(lián)免疫和qRT-PCR技術檢測TNBC組織和血清中RHBDD1和EGFR mRNA含量及蛋白表達，為TNBC治療尋找新的靶點。

1 材料與方法

1.1 臨床資料選取2015年～2018年在包頭醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院及包頭市腫瘤醫(yī)院行乳腺癌根治性切除術的患者為研究對象，每例均切取乳腺癌組織及對應癌旁正常乳腺組織，用于提取RNA及石蠟包埋。采集乳腺癌患者血清儲存于-80 ℃用于酶聯(lián)免疫檢測，隨機選取60例健康體檢者(無腫瘤病史及家族史)血清作為對照組。對所有乳腺癌組織進行ER、PR、HER2免疫組化檢測，30例ER、PR、HER2均陰性，為TNBC組，從其余乳腺癌患者中隨機選取30例作為非三陰型乳腺癌(non triple negative breast cancer, NTNBC)組(ER、PR、HER2至少一項陽性)，所選病例患者年齡26～82歲，中位年齡51歲。按照Nottingham組織學分級系統(tǒng)[2]進行計分及組織學分級，根據(jù)腺管數(shù)量(1～3分)、核異型程度(1～3分)、核分裂項計數(shù)(1～3分)計分，Ⅰ級3～5分，Ⅱ級6～7分，Ⅲ級8～9分；所有病理切片均由兩位高級職稱病理醫(yī)師采用雙盲法進行判讀。采用美國癌癥聯(lián)合委員會(AJCC)乳腺癌TNM分期進行臨床分期。

1.2 方法

1.2.1免疫組化 采用免疫組化MaxVision法進行免疫組化染色，手術切除標本先經(jīng)10%中性福尓馬林固定，然后脫水、石蠟包埋、脫蠟、水化、抗原修復、滴加抗體、DAB顯色、復染、封片。試劑盒購自福州邁新公司，所有操作步驟均嚴格按照試劑盒說明書進行。

結(jié)果判定標準：所有結(jié)果均經(jīng)診斷醫(yī)師采用雙盲法進行確認。根據(jù)染色程度進行評分：基本不著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，深棕色為3分。每張切片隨機選取5個高倍視野，計算出每個視野陽性染色腫瘤細胞的百分數(shù)，并取其平均值進行評分：陽性染色腫瘤細胞的百分數(shù)<1為0分，10%～24%為1分，25%～49%為2分，50%～74%為3分，75%～100%為4分。最后將兩項評分結(jié)果相乘：0分為陰性(-)；1～12分陽性。其中l(wèi)～4分為(+)，5～8分為()，9～12分為()。

1.2.2酶聯(lián)免疫法 檢測乳腺癌患者血清中RHBDD1和EGFR蛋白，試劑盒均購自武漢新啟迪生物公司。從已平衡至室溫的密封袋中取出試驗所需的板條，預留空白孔，分別將標本加入相應孔中37 ℃孵育90 min，洗板2次，加入生物素化人RHBDD1或EGFR抗體工作液，37 ℃孵育60 min，洗板3次，除空白孔外，加入酶結(jié)合物工作液。37 ℃避光孵育30 min，洗板5次。加入酶結(jié)合物工作液，37 ℃避光孵育，當標準曲線高濃度的顏色較深，有明顯的顏色梯度時即可終止。加入終止液，混勻后即刻測量OD(450 nm)值。

1.2.3qRT-PCR 采用qRT-PCR技術檢測乳腺癌中RHBDD1 mRNA的含量。RNA提取試劑盒(DP431)購自天根生化公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(#k1621)購自Thermo Scientific公司。qRT-PCR試劑盒(B532955)購自上海生工生物公司。RHBDD1、EGFR和β-actin的引物序列由上海生工生物公司合成。β-actin的引物序列：上游5′-TGTCCCTGTA CACCTCTG-3′，下游5′-ATGTCACGCACGATTTCCC-3′，擴增產(chǎn)物長度為217 bp。RHBDD1的引物序列：上游5′-GCCTATGTTATCACCGCATTTTC-3′，下游5′-GCTCCTTTTGAAGTCAGGTTCAT-3′，擴增產(chǎn)物長度為102 bp。EGFR引物序列：上游5′-GGACTCTGGA TCCCAGAAGGTG-3′，下游5′-GCTGGCCATCACG TAGGCTT-3′，產(chǎn)物大小為244 bp。qRT-PCR的反應體系為20 μL，反應條件為恒溫段：95 ℃ 30 s，循環(huán)段：95 ℃ 5 s ，然后60 ℃ 30 s ，熔解段：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 h，95 ℃ 15 s，共40個循環(huán)。

記錄CT值，計算ΔCT和ΔΔCT值，最后結(jié)果取ΔΔCT的均值，即為RHBDD1 mRNA和EGFR mRNA的相對含量。

1.3 統(tǒng)計學分析采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料比較采χ2檢驗，計量資料比較采用t檢驗，相關性分析采用r相關性分析和Spearman秩相關檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織中ER、PR、HER2的表達ER、PR陽性定位于細胞核，HER2陽性定位于細胞膜，與乳腺癌診療規(guī)范(2018)評定標準一致。把ER、PR、HER2均陰性歸為TNBC組，把ER、PR、HER2至少一項陽性歸為NTNBC組。

2.2 TNBC和NTNBC組織中RHBDD1和EGFR的表達采用免疫組化法對TNBC和NTNBC組織和癌旁組織中RHBDD1和EGFR蛋白進行檢測，結(jié)果顯示RHBDD1陽性定位于細胞質(zhì)和細胞膜，EGFR陽性定位于細胞膜(圖1、2)，RHBDD1在TNBC組中的陽性率(83%)高于NTNBC組(67%)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，EGFR在TNBC組中的陽性率(80%)明顯高于NTNBC組(37%)，兩組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。RHBDD1和EGFR在TNBC中的表達呈正相關(r=3.723，P<0.05)。RHBDD1和EGFR在TNBC組和NTNBC組中的表達均與患者年齡無關，與臨床分期、組織學分級、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移有關(表1)。

2.3 乳腺癌患者和健康體檢者血清中RHBDD1和EGFR的濃度采用酶聯(lián)免疫法對60例乳腺癌患者和60例健康體檢者血清進行RHBDD1和EGFR檢測，結(jié)果顯示乳腺癌患者血清中RHBDD1、EGFR含量明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。TNBC組RHBDD1、EGFR的含量高于NTNBC組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖3)。

2.4 TNBC和癌旁正常乳腺組織中RHBDD1 mRNA和EGFR mRNA的含量以β-actin為內(nèi)參，應用qRT-PCR技術對30例TNBC和癌旁正常乳腺組織中RHBDD1和EGFR進行檢測，擴增的產(chǎn)物經(jīng)2%的凝膠電泳，證實為RHBDD1、EGFR，長度分別102、244 bp(圖4)。

表1 三陰型乳腺癌和非三陰型乳腺癌組織中RHBDD1和EGFR的表達與臨床病理特征的關系[(n)%]

①A①B②A②B

圖1非三陰型乳腺癌中RHBDD1(A)和EGFR(B)呈強陽性，MaxVision法圖2非三陰型乳腺癌中RHBDD1(A)和EGFR(B)呈陰性，MaxVision法

圖3 不同組別血清中RHBDD1和EGFR濃度檢測NTNBC組. 非三陰型乳腺癌組；TNBC組. 三陰型乳腺癌組

圖4 三陰型乳腺癌組織中RHBDD1、EGFR基因擴增PCR凝膠電泳：M.Marke；1～3.EGFR；4～6.RHBDD1

TNBC組中RHBDD1 mRNA和EGFR mRNA的含量均高于癌旁正常組，分別是3.68倍和4.56倍，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中RHBDD1 mRNA和EGFR mRNA的含量分別是無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的4.72倍和5.31倍，遠處轉(zhuǎn)移組的RHBDD1 mRNA和EGFR mRNA的含量顯著高于無遠處轉(zhuǎn)移組，分別是4.89倍和5.55倍(圖5)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖5 三陰型乳腺癌組織中RHBDD1 mRNA、EGFR mRNA的相對含量

3 討論

TNBC是乳腺浸潤癌的一種分子亞型，不表達ER、PR和HER2，TNBC患者的內(nèi)分泌治療和抗HER2的靶向治療效果不佳，且預后差，易復發(fā)，易侵襲轉(zhuǎn)移，病死率較高?，F(xiàn)在對于TNBC患者，主要是行常規(guī)手術切除治療和化療[4-5]，也有學者對晚期TNBC患者進行全身治療的諸多試驗正在進行，并取得了一定成果[6]。近幾年，國內(nèi)外研究者尋求TNBC治療的新分子靶點，針對TNBC患者采用個體化靶向治療，使乳腺癌患者最終受益。

EGFR是表皮生長因子受體家族的一個成員，其可以激活下游通路，導致細胞增殖分化，促使腫瘤形成。國內(nèi)外許多研究結(jié)果表明EGFR在乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌等許多腫瘤中出現(xiàn)異常高表達，其通過激活下游信號通路，促進腫瘤細胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移[7-9]。

本實驗采用免疫組化法檢測EGFR在TNBC組織中高表達，與文獻報道結(jié)果一致[10]。采用酶聯(lián)免疫法檢測乳腺癌患者血清中EGFR的表達，血清中EGFR含量高于健康人群，TNBC組患者血清中EGFR的含量明顯高于NTNBC組?，F(xiàn)在國內(nèi)外研究對EGFR下游通路活化的機制較為清楚，但是如何調(diào)控和激活EGFR一直是眾多研究者所關注的熱點。本實驗組在前期實驗[11]發(fā)現(xiàn)RHBDD1和EGFR在乳腺癌中的表達呈正相關，RHBDD1可能激活EGFR，誘導腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移。

RHBDD1是新發(fā)現(xiàn)的Rhomboid家族成員，Rhomboid家族包含一個特殊的絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域，是一類能夠切割單一跨膜蛋白結(jié)構(gòu)域的絲氨酸蛋白酶，具有促進細胞增殖、抑制細胞凋亡的作用[12-13]，有文獻報道[14]RHBDD1在乳腺癌組織中高表達，本實驗組從乳腺癌患者組織和血清中發(fā)現(xiàn)RHBDD1高表達，尤其是TNBC組明顯高于NTNBC組，相關性分析結(jié)果表明RHBDD1表達與TNBC的發(fā)病年齡無關，與臨床分期、病理分級、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移有關，進一步分析發(fā)現(xiàn)，TNBC組中RHBDD1和EGFR表達呈正相關。提示RHBDD1可能在癌組織中發(fā)揮上調(diào)EGFR蛋白的作用，激活EGFR下游通路，促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。有研究[15]證實RHBDD1可以通過調(diào)節(jié)C-Jun的表達來調(diào)節(jié)EGFR mRNA的表達。隨后對TNBC組織提取的RNA進行了qRT-PCR檢測，結(jié)果表明在TNBC組織中RHBDD1 mRNA和EGFR mRNA的含量高于癌旁組織，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移的組織中，尤其是發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的組織，RHBDD1 mRNA和EGFR mRNA的含量更高，從核酸水平進一步證實RHBDD1和EGFR在TNBC發(fā)生和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。

本實驗從組織和血清兩方面進行檢測，檢測到RHBDD1和EGFR蛋白在TNBC中高表達，從蛋白和RNA水平兩方面均說明RHBDD1和EGFR在TNBC的發(fā)生和轉(zhuǎn)移中具有協(xié)同作用，RHBDD1和EGFR可作為TNBC預后和臨床診療的分子靶點，為TNBC的臨床診治提供新的理論基礎。