譚克龍，宮愛艷

（中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081）

雞傳染性喉氣管炎（Avian infectious laryngotracheitis，AILT）是由傳染性喉氣管炎病毒（Infectious laryngotracheitis，ILTV）感染引發(fā)雞的一種急性、接觸性呼吸系統(tǒng)疾病。ILTV 屬于皰疹病毒科、傳喉炎病毒屬。該病毒傳播速度快，感染率高達95%～100%，感染后難以清除。該病的致死率根據(jù)ILTV毒力不同以及雞只個體免疫力差異從10%～70%不等，ILTV 可感染所有年齡的蛋、肉、種用家禽，嚴(yán)重影響雞只的生產(chǎn)性能，是一種危害世界養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的重要傳染病[1]。當(dāng)前，防治AILT 主要依賴活病毒疫苗激發(fā)的宿主免疫應(yīng)答。然而，現(xiàn)有疫苗免疫保護力不強，ILTV 疫苗免疫過的雞場仍然不斷爆發(fā)新的疫情[2]?；诋?dāng)前AILT 防疫現(xiàn)狀，深入研究ILTV 與宿主互作過程有望為研發(fā)安全、長效的AILT免疫制劑提供新思路。

細胞粘附分子能夠參與機體多種重要的生理功能和病理過程，如組織細胞間的附著、腫瘤的浸潤與轉(zhuǎn)移、各種細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)、作為免疫細胞識別的輔助受體和協(xié)同活化信號等。已有研究資料顯示，粘附分子可以作為特異性結(jié)合α皰疹病毒的細胞表面受體，在α皰疹病毒感染宿主的初期參與病毒與宿主細胞的相互識別，進而促進病毒感染過程[3]。其中，鈣粘蛋白11（CDH11）和神經(jīng)生長調(diào)節(jié)蛋白1（NEGR1）是細胞內(nèi)重要的細胞粘附分子。CDH11 鈣黏附蛋白是一種單鏈跨膜糖蛋白，在細胞間連接中起到重要作用，可通過TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)細胞干性的促凋亡腫瘤抑制子[4-5]。NEGR1 是一種借由GPI錨定在細胞膜表面的蛋白，可通過調(diào)控受體酪氨酸激酶相關(guān)通路，如FGFR2-ERK 信號通路，調(diào)控細胞形態(tài)[6-7]。已有研究報道，宿主原癌基因酪氨酸蛋白激酶（Src）是ILTV 感染的關(guān)鍵宿主調(diào)控因子，可通過調(diào)控宿主細胞粘附過程而發(fā)揮作用，多功能蛋白聚糖（VCAN）是其互作主要粘附因子[8]。本研究利用ILTV 毒株感染雛雞，通過ILTV 組織嗜性以及細胞粘附相關(guān)基因CDH11、NEGR1和VCAN 的表達水平檢測，探索ILTV 感染組織嗜性與細胞粘附分子間的關(guān)系，以期為新型免疫制劑的研制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒株及實驗動物 ILTV NP-3 毒株由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所分離保存；SPF 雞由新興大華農(nóng)禽蛋有限公司提供。

1.2 主要實驗試劑 AxyPrep病毒DNA/RNA小量試劑盒購自美國Axygen 公司；One Step PrimeScript?RTPCR Kit Ⅱ（Perfect Real Time）和Premix ExTaqTM（Probe qPCR）購自TakaRa 公司；膠回收試劑盒購自O(shè)mega 公司；TRIzol 試劑購自Invitrogen 公司。

1.3 引物、探針的設(shè)計與合成 參照文獻[8]合成檢測編碼ILTV gC 糖蛋白基因的特異性引物和探針，以及檢測細胞粘附相關(guān)基因CDH11、NEGR1 和VCAN 特異性引物（表1），引物和探針由北京六合華大基因有限公司合成。

表1 所用的引物及探針序列Table 1 The primer and probe sequences used in this study

1.4 病毒接種動物及樣品采集 將6 只28 日齡的SPF 雞隨機分成兩組，攻毒組用病毒滴度為10-3.0TCID50的ILTV NP-3 病毒株采用滴鼻方式進行攻毒，劑量為200 μL/只，對照組接種相同劑量的PBS。于攻毒5 d 后（33 日齡），無菌采集兩組實驗雞喉頭、氣管、哈德氏腺、骨髓、腺胃、肺臟、盲腸、腦、盲腸扁桃體、小腸、大腸、腎臟、十二指腸、胰腺、法氏囊、脾臟、胸腺、肝臟等組織樣品，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 組織中病毒載量的檢測 采用AxyPrep 病毒DNA/RNA 小量提取試劑盒提取采集的組織樣本總DNA，利用設(shè)計的引物ILTV-gC-F/R 及探針I(yè)LTVgC-Probe 對各組織中ITLV 病毒載量進行測定。反應(yīng)程序為：95 ℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃20 s，40 個循環(huán)，計算病毒含量。

1.6 感染ILTV 雞只各組織中細胞粘附相關(guān)基因的表達水平檢測 采用TRIzol 法提取攻毒組和對照組實驗雞各組織的總RNA，利用One Step PrimeScript?RT-PCR Kit Ⅱ檢測各組織中細胞黏附相關(guān)基因CDH11、NEGR1 和VCAN 的表達水平。反應(yīng)程序為：42 ℃5 min， 95 ℃10 s；95 ℃5 s，60 ℃30 s，40 個循環(huán)，以18S RNA 為內(nèi)參基因，對比分析檢測結(jié)果，利用SPSS 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

1.7 細胞粘附相關(guān)基因表達水平與ILTV 組織嗜性相關(guān)性分析 分別采用相關(guān)性分析采用肯德爾相關(guān)性系數(shù)（Kendall correlation coefficient）和斯皮爾曼相關(guān)性系數(shù)（Spearman correlation coefficient）檢測1.5 和1.6 中兩組數(shù)據(jù)間的相關(guān)性，當(dāng)p＜0.05 時表示差異顯著。

2 結(jié)果和討論

2.1 雛雞攻毒后不同組織中ILTV 載量檢測結(jié)果利用qPCR 測定SPF 雛雞感染ILTV 后不同組織中病毒載量情況，結(jié)果顯示，喉頭和氣管中ILTV 載量最高，是病毒感染的主要部位；其次在哈德氏腺、骨髓、肺臟、盲腸、腦、盲腸、扁桃體以及小腸樣本中也檢測到ILTV 的存在，而在大腸、腎臟、十二指腸、胰腺、法氏囊、脾臟、胸腺、肝臟等組織中病毒核酸呈陰性（圖1）。以上檢測結(jié)果表明，ILTV 感染存在明顯的組織偏嗜性。

圖1 SPF 雛雞感染ILTV 不同組織中的病毒載量檢測結(jié)果Fig.1 Detection results of viral load in different tissues about SPF chicks infected with ILTV

2.2 雛雞攻毒ILTV 后不同組織中細胞粘附相關(guān)基因的表達水平檢測結(jié)果 利用RT-qPCR 檢測細胞粘附分子CDH11、NEGR1 和VCAN 的基因表達水平。結(jié)果顯示，在ILTV 陰性組織中，僅胰腺中CDH11表達水平上調(diào)，除肝臟中CDH11 表達水平無顯著變化外，其它組織中均呈現(xiàn)顯著下調(diào)；在ILTV 陽性組織中，盲腸和扁桃體中的CDH11 表達水平顯著下調(diào)，腦和骨髓中的CDH11 表達水平顯著上調(diào)，而其它組織則變化不顯著（圖2）。NEGR1 的表達在ILTV陰性組織十二指腸、胰腺、脾臟和肝臟中均未檢測到，在腎臟中NEGR1 表達量顯著下調(diào)；在病毒陽性組織中，NEGR1 僅在骨髓中無表達，在喉頭、腦表達下調(diào)，其中喉頭下調(diào)顯著。VCAN 的表達除在法氏囊中顯著上調(diào)外，在其它ILTV 陰性和陽性組織中均無明顯變化。以上結(jié)果初步表明，雛雞感染ILTV后CDH11 和NEGR1 的組織表達模式與病毒的組織偏嗜性呈現(xiàn)負相關(guān)，而VCAN 的表達與病毒的組織偏嗜性無相關(guān)性。

圖2 細胞粘附相關(guān)基因在不同組織中的表達Fig.2 The expression of cell adhesion related genes in different tissues

2.3 相關(guān)基因表達水平與ILTV 的組織分布相關(guān)性分析 利用SPSS 16.0 軟件對影響皰疹病毒感染生物學(xué)過程相關(guān)基因的表達水平變化與ILTV 的組織分布進行相關(guān)性分析，判定標(biāo)準(zhǔn)為0.5≤|r|＜0.8 中度相關(guān)，0.3≤|r|＜0.5 低度相關(guān)，|r|＜0.3 關(guān)系極弱，認(rèn)為不相關(guān)。結(jié)果顯示，CDH11 的表達水平與ILTV 在各組織分布呈中度正相關(guān)，NEGR1 的表達水平變化與ILTV 在各組織分布呈低度正相關(guān)，VCAN 的表達水平變化與ILTV 在各組織分布相關(guān)性并不顯著（表2），提示ILTV 在感染過程中可能需要通過宿主CDH11和NEGR1 調(diào)控宿主細胞的代謝、凋亡及細胞骨架等借由細胞粘附分子引發(fā)調(diào)控的生物學(xué)過程來促進病毒的增殖和擴散。Kendall 和Spearman 兩種分析方法所得到的相關(guān)性結(jié)果一致。

表2 基因的表達水平變化與ILTV 在各組織分布的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of gene expression level changes and ILTV distribution in different tissues

綜上所述，本研究分析了ILTV 感染宿主后病毒在宿主體內(nèi)的組織分布與宿主細胞粘附相關(guān)基因表達水平的相關(guān)性，提示機體細胞粘附相關(guān)生物學(xué)過程可在ILTV 體內(nèi)感染中起到關(guān)鍵作用，為闡明ILTV 感染組織嗜性差異機制奠定了基礎(chǔ)。